• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    花藥培養(yǎng)過程中的滅菌與消毒

    2011-12-25 09:20:56王裔娜
    關(guān)鍵詞:花藥培養(yǎng)花藥工作臺

    王裔娜

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,河南鄭州 450002)

    花藥培養(yǎng)過程中的滅菌與消毒

    王裔娜

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,河南鄭州 450002)

    利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對花藥進行組織培養(yǎng),結(jié)合實驗操作經(jīng)驗,總結(jié)了培養(yǎng)基、無菌室和超凈工作臺的滅菌方法,論述了工具器皿的消毒過程,分析了花藥的預(yù)處理與消毒方法,給出了常用消毒劑的使用方法.

    花藥;培養(yǎng);滅菌;消毒;溫度

    0 引言

    植物組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細胞具有全能性的理論,在無菌條件下,將離體的植物根尖、莖尖、組織、細胞、胚胎、原生質(zhì)體、懸浮細胞等在人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng),給予適宜的培養(yǎng)條件,誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽或長成完整的植株的技術(shù).植物組織培養(yǎng)也稱離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng).

    花是被子植物特有的有性生殖器官,在花中形成有性生殖過程中的雌、雄生殖細胞,以繁衍后代,延續(xù)種族,而花藥則是雄蕊的重要組成部分.從結(jié)構(gòu)上看,花藥是由藥壁、藥隔、花粉囊和花粉粒組成.花藥培養(yǎng)是指將完整的花藥接種到培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)形成單倍體再生植株的方法.花藥是幾乎所有植物器官中很好的無毒部分,因此是進行選育優(yōu)良單倍體植株或獲得純系育種材料的最佳選擇.

    花藥培養(yǎng)的主要目的是進行單倍體育種,縮短育種年限和提高育種效率及獲得純系育種材料.在育種領(lǐng)域中,花藥培養(yǎng)育種已與常規(guī)雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合,是生物技術(shù)在農(nóng)作物育種中應(yīng)用最廣泛、最有成效的方法之一.但是在花藥培養(yǎng)過程中,如果控制不好,污染是經(jīng)常發(fā)生的.滅菌和消毒是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié),這個關(guān)鍵環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤或者操作不當(dāng)就會造成花藥培養(yǎng)失敗,前功盡棄.

    1 花藥培養(yǎng)基的滅菌

    由于花藥培養(yǎng)基在制備過程中帶有各種雜菌,所以微生物污染開始就在培養(yǎng)基中存在.分裝后的培養(yǎng)基應(yīng)立即滅菌,至少應(yīng)該在24 h之內(nèi)完成滅菌工作,常規(guī)方法是采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌.

    1.1 理論滅菌時間的確定

    微生物的濕熱滅菌過程,其本質(zhì)上就是微生物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性過程,從這個意義上講,滅菌過程應(yīng)遵循單分子反應(yīng)的速度理論[1],即滿足方程

    式中,N表示殘存的活菌數(shù),t表示滅菌時間,K表示滅菌速度常數(shù),也稱反應(yīng)速度常數(shù),此常數(shù)的大小與微生物的種類與加熱溫度有關(guān),dN/dt表示活菌數(shù)瞬時變化速率,即死亡速率.該方程稱為對數(shù)殘存定律,表示微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數(shù)成正比.

    將(1)式積分,轉(zhuǎn)換得

    其中,K表示滅菌速度常數(shù),t表示理論滅菌時間,Nt是經(jīng)時間t后殘存的活菌數(shù),N0是t=0時原有活菌數(shù).

    在計算理論滅菌時間時首先要注意K值與微生物種類、生理狀態(tài)、外界環(huán)境等有關(guān)系,即K是微生物熱阻的一種表示形式,微生物的熱阻越大,K值越小.其次N0可以參考一般培養(yǎng)基中的活微生物數(shù)為(1-2)× 107個/mL,Nt通常取0.001個,即滅菌失敗的概率為1/1 000.最后,理論滅菌時間只可以用于工程計算中,在實踐過程中,因蒸汽的壓力不穩(wěn)定、蒸汽的流量大小等很多因素影響使得理論滅菌時間與實際滅菌時間有很大差別.可結(jié)合經(jīng)驗數(shù)值做適當(dāng)調(diào)整.

    1.2 滅菌溫度的選擇

    在花藥培養(yǎng)基滅菌過程中,除了雜菌死亡,還伴隨著花藥培養(yǎng)基成分的破壞.因此必須選擇既能達到滅菌目的,又能使花藥培養(yǎng)基的破壞降至最低的溫度.

    首先,由于微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng),根據(jù)文獻[2],其滅菌速度常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示:

    其中T表示絕對溫度,A表示頻率常數(shù),也稱阿累尼烏斯常數(shù),E表示微生物死亡活化能,R是氣體常數(shù).E/R表示了微生物受熱死亡時對溫度敏感性的度量,它是加熱滅菌操作中十分重要的參數(shù).當(dāng)E與R比值增大時,微生物死亡速率就會隨溫度的變化而敏感度增加;反之,敏感度降低.

    其次,根據(jù)文獻[3],當(dāng)滅菌溫度從T1上升到T2時,滅菌的反應(yīng)速度常數(shù)K值和營養(yǎng)成分分解的反應(yīng)速度常數(shù)K'分別從K1、K'1變化到K2、K'2.若用E和E'分別表示殺死微生物的活化能和營養(yǎng)成分的活化能,那么由阿累尼烏斯公式可得

    由于殺死微生物的活化能E大于營養(yǎng)成分的活化能E',所以隨溫度的升高,滅菌反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)大于營養(yǎng)成分破壞反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù).雖然隨著滅菌溫度上升,微生物死亡的速率會提高,培養(yǎng)基成分的破壞速率也會增加,但是微生物死亡的速率增加度會超過培養(yǎng)基成分的破壞速率增加度.因此,采用高溫快速滅菌方法,不僅可殺死培養(yǎng)基中的全部有生命的有機體,而且可減少營養(yǎng)成分的破壞.

    具體的方法是,把已裝入花藥培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器直接裝入內(nèi)鍋,上面蓋幾張報紙吸濕.接通電源升溫后,首先要排凈鍋內(nèi)冷空氣,然后在121℃(1.06 kg/cm2或0.105 MPa)下滅菌15~20 min,可完全殺死物品內(nèi)外的微生物、芽孢和孢子.

    2 工具器皿的消毒

    植物組織培養(yǎng)的主要過程都是在無菌條件下進行的,在培養(yǎng)過程中所用到的工具器皿,如花藥培養(yǎng)基、花藥培養(yǎng)瓶、操作工具器械等都必須防止和消除細菌、真菌、藻類及其他微生物的污染,均需消毒處理.

    2.1 接種器械和玻璃器皿、塑料器皿的滅菌

    對于無菌操作所用的接種器械包括解剖針、解剖刀、槍形鑷和扁頭小鏟等,一般的消毒辦法是把它們先在95%酒精中浸一下,然后再置火焰上灼燒片刻,待冷卻后使用.這些器械不但在每次操作開始前消毒,在操作期間還要消毒幾次.接種器皿在操作過程中,由于直接與外植體接觸,所以必須經(jīng)過嚴格滅菌后才能使用.玻璃培養(yǎng)容器常常與培養(yǎng)基一起滅菌.若培養(yǎng)基已先滅菌,而只需單獨進行容器滅菌時,可采用高壓蒸汽滅菌法,也可將它們置于烘箱中在160℃~180℃下干熱處理3 h.有些類型的塑料器皿也可進行高溫消毒.滅菌方法為:在121℃下反復(fù)進行高壓蒸汽滅菌,每次滅菌的時間不應(yīng)超過20 min,然后放在干燥箱內(nèi)進行干燥.

    2.2 蒸餾水和濾紙的滅菌

    將不超過瓶2/3的蒸餾水或濾紙分別置于三角瓶中,用棉塞密封瓶口,排放在高壓滅菌鍋中,加溫121℃,滅菌20 min.冷卻后即為無菌水,放在超凈工作臺上備用.

    2.3 組培苗和組培瓶的滅菌處理

    花藥組培瓶內(nèi)組培苗的污染會導(dǎo)致植物組織培養(yǎng)的失敗,凡出現(xiàn)污染的組培苗或外植體一般都不能再用.花藥組培瓶內(nèi)組培苗的污染一般有細菌污染和真菌污染,或者在同一瓶內(nèi)同時存在細菌污染和真菌污染.通常細菌污染都在接種后2~3 d開始出現(xiàn),真菌污染在接種后3~5 d出現(xiàn).清除污染最好的方法是先將外植體連組培瓶進行高壓蒸汽滅菌,然后把內(nèi)部的外植體連同培養(yǎng)基扔掉,再把瓶子刷洗干凈備用.

    3 無菌操作區(qū)及操作人員的消毒與滅菌

    3.1 無菌室的消毒和滅菌

    組培實驗操作必須在無菌操作室進行,紫外輻射是組織培養(yǎng)實驗室常用的一種物理殺菌手段,因此,無菌室內(nèi)一般裝備有紫外消毒燈.無菌室的消毒要在接種前一天的晚上將紫外燈打開,消毒12 h后關(guān)閉,即可使用.

    3.2 超凈工作臺的消毒和滅菌

    超凈工作臺又稱潔凈工作臺,是組織培養(yǎng)實驗的關(guān)鍵設(shè)備.在超凈工作臺中進行操作是最容易感染細菌等污染物的時候,如有不慎就會導(dǎo)致實驗失敗,甚至造成一定的經(jīng)濟損失,因此對超凈工作臺的消毒和之后進行操作的過程中都要注意避免污染.組培操作前,用酒精棉球?qū)⒐ぷ髋_仔細擦拭兩遍,尤其是潔凈工作臺的接口處一定要反復(fù)擦拭,操作人員的雙手和兩臂必須徹底洗凈,而且千萬不要讓手和手臂越過敞著口的無菌容器的上方,防止細菌、手部死皮等污染物掉進容器里.所有敞口的無菌表面都盡可能放在超凈臺的遠后方.打開臺內(nèi)紫外燈15~30 min,然后關(guān)掉紫外燈并打開超凈工作臺風(fēng)機,20 min后即可進行實驗操作.紫外輻射同樣傷害皮膚,所以在沒有采取保護措施的條件下,不要把手伸入開著紫外燈的超凈臺內(nèi).

    在植物組培操作過程中,超凈工作臺的風(fēng)機要始終打開,形成無塵無菌的工作環(huán)境.此外,在每次操作之前,要把實驗材料和在操作中必須使用的各種器械、藥品等先放入臺內(nèi),不要中途拿進,同時,臺面上放置的東西不宜太多,特別注意不要在迎面堆得太高,以致?lián)踝饬?

    3.3 接種工作者自身的消毒與滅菌

    接種工作者自身的消毒與滅菌分為三個內(nèi)容,首先是工作人員的工作服和工作帽的消毒,方法是經(jīng)過紫外線照射25 min以上,這樣才能達到無菌的程度;其次是實驗前要用肥皂洗手,把手掌和手臂一起洗干凈,穿好工作服戴好帽子;最后是進入超凈工作臺后要用70%~75%酒精擦拭雙手.

    需要注意的是,在滅菌過程中如果粗心大意,防護不當(dāng),有可能造成健康損傷.如次氯酸鈉是一種常用的化學(xué)消毒劑,接觸皮膚會造成傷害,若是在開著紫外燈的情況下使用次氯酸鈉,由于這時次氯酸鈉會釋放出游離氯氣,更會嚴重損害健康.

    4 花藥的預(yù)處理與消毒

    從自然界和室內(nèi)采集的植物器官和組織材料一般都帶有各種微生物,這些污染源一旦進入培養(yǎng)瓶中,會造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料污染.因此在花藥組織培養(yǎng)中,無菌的外植體材料是取得植物組織培養(yǎng)成功的最基本的前提和根本保證,也是組織培養(yǎng)的一大障礙.因此在材料接種培養(yǎng)前必須消毒處理,消毒一方面要求把材料表面上的各種微生物殺滅,同時又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長.

    4.1 花藥的預(yù)處理

    適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率.常用的預(yù)處理方法是低溫冷藏,具體的處理溫度和時間長度因物種而異.但低溫預(yù)處理對小麥效果不穩(wěn)定,有時還有負效果.

    4.2 花藥的消毒

    通常用于組織培養(yǎng)的花藥,按小孢子發(fā)育時期要求,實際上大多沒有成熟,花藥外面有萼片、花瓣或穎片、稃片保護著,基本上處于無菌狀態(tài).但是如果出現(xiàn)附著其上的微生物等污染情況,由于花藥被包在花被里面,很難將其徹底消除,也不容易控制花藥的消毒時間,為此,我們對此進行研究,取得了較好的效果.

    4.2.1 花藥消毒的步驟

    ①選好所需要的一種或幾種消毒劑,如70%酒精、0.5%新潔爾滅、1%次氯酸鈉等,放好待用;②去除花萼,滴入少許洗潔精,用自來水沖洗2~4 h;③在無菌條件下,用70%酒精表面消毒30 s后,再用不同消毒劑繼續(xù)消毒;④用無菌水清洗4~5次;⑤無菌試紙吸干花蕾表面水分后,剝掉花瓣取下花藥,立即接種于無菌培養(yǎng)基上;⑥在溫度為25℃的培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng),每隔3~5 d觀察記錄一次,直到結(jié)果不再變化為止.

    4.2.2 常用的消毒劑

    理想的消毒劑的標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)具有消毒效果好易被無菌水沖洗掉或能自行分解,對材料損傷小,對人體及其他生物無害,來源廣泛,價格低廉.以下列舉幾種常用消毒劑[4].

    ①升汞.又稱氯化汞,Hg2+可以與帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,使蛋白質(zhì)變性,從而殺死菌體.升汞的消毒效果極佳,但其滲透性過強,易在植物材料上殘留,對環(huán)境危害大,對人畜的毒性極強.

    ②酒精.酒精是最常用的表面消毒劑,但是不同濃度的酒精殺菌效果差別很大,10%~20%的酒精無殺菌作用,70%~75%酒精殺菌效果最好,95%~100%的酒精會使菌體表面的蛋白質(zhì)凝固,形成一層保護膜,阻止了酒精的繼續(xù)滲入,殺菌效果大大降低.

    酒精具有較強的穿透力,使菌體蛋白質(zhì)變性,殺菌效果好.同時它還具有較強的濕潤作用,可排除材料上的空氣,利于其他消毒劑的滲入.但酒精對植物材料的殺傷作用也很大,浸泡時間不宜過長,并且酒精不能徹底消毒,一般不單獨使用,多與其他消毒劑配合使用.

    ③次氯酸鈉.次氯酸鈉是一種較好的消毒劑,它可以釋放出活性氯離子,從而殺死菌體.其消毒能力強,不易殘留,對環(huán)境無害.但次氯酸鈉溶液堿性很強,對植物材料也有一定的破壞作用.

    ④漂白粉.漂白粉的有效成分是Ca(ClO)2,消毒效果很好,對環(huán)境無害.它易吸潮散失有效氯而失效,故要密封保藏.

    ⑤過氧化氫.也稱雙氧水,消毒效果好,易清除,又不會損傷外植體,常用于葉片的消毒.

    ⑥新潔爾滅.這是一種廣譜表面活性消毒劑,對絕大多數(shù)植物外植體傷害很小,殺菌效果好.

    5 結(jié)論

    滅菌與消毒是防止微生物污染的最基本的環(huán)節(jié),是花藥組織培養(yǎng)技術(shù)中一項重要的工作[5].花藥組培過程中,針對不同的物品要采用不同的滅菌和消毒的方法.培養(yǎng)基用常壓或高壓蒸煮等濕熱滅菌、器械采用灼燒滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌、植物材料表面用消毒劑滅菌、物體表面用藥劑噴霧滅菌、接種室等空間采用紫外線或熏蒸滅菌.

    [1]熊宗貴.發(fā)酵工藝原理[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001:82-98.

    [2]趙德勝,韓文清,張明斗.培養(yǎng)基滅菌溫度與時間的選擇[J].價值工程,2010(5):205-206.

    [3]高平,劉書志.生物工程設(shè)備[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:180-220.

    [4]陳建華,王玲,尹桂芳,等.影響魔芋花藥培養(yǎng)褐變因素研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,23(2):458-461.

    [5]龐海峰,王平,姜策.矮牽?;ㄋ幣囵B(yǎng)的研究[J].北方園藝,2007(5):196-197.

    Disinfection and Sterilization in Anther Cultivation Progress

    WANG Yi-na

    (Institute of Horticulture,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

    By application of plant tissue cultivation technology on cultivation of anther tissue,and combining operation experience,summarizes sterilization method of media,sterile room and ultra clean bench.The sterilization process of vessels and tools is discussed.Furthermore,analyzes method of anther pretreatment and its disinfection,and shows usage of common disinfectants.

    anther;cultivation;sterilization;disinfection;temperature

    Q944.6

    A

    1007-0834(2011)03-0047-04

    10.3969/j.issn.1007-0834.2011.03.016

    2011-04-25

    王裔娜(1989—),女,河南鄭州人,河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院.

    猜你喜歡
    花藥培養(yǎng)花藥工作臺
    不同基因型水稻花藥培養(yǎng)效果的比較研究
    不同培養(yǎng)基對水稻花藥培養(yǎng)力的影響
    一種適用于聯(lián)動加工的數(shù)控回轉(zhuǎn)工作臺
    重型回轉(zhuǎn)工作臺的復(fù)合增力夾緊機構(gòu)的設(shè)計
    一種閉式靜壓回轉(zhuǎn)工作臺新型結(jié)構(gòu)設(shè)計
    生態(tài)因子對滇重樓花藥開裂的影響
    廣西植物(2016年10期)2016-11-11 06:51:39
    雜交秈稻花藥基部開裂性狀的遺傳研究
    基于單片機控制的快捷包裝工作臺結(jié)構(gòu)設(shè)計
    松花菜花藥培養(yǎng)再生植株
    柱花草花藥離體培養(yǎng)研究
    中文字幕制服av| 精品少妇内射三级| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲少妇的诱惑av| 18在线观看网站| 国产成人免费无遮挡视频| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久国产成人免费| 9191精品国产免费久久| 久久狼人影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲精品乱久久久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 性高湖久久久久久久久免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲黑人精品在线| 国精品久久久久久国模美| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久精品成人免费网站| 99九九在线精品视频| kizo精华| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品福利观看| 丝袜美腿诱惑在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲av欧美aⅴ国产| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲视频免费观看视频| 久久九九热精品免费| 在线 av 中文字幕| 十八禁网站免费在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲国产av新网站| 一级a爱视频在线免费观看| 天天添夜夜摸| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 最黄视频免费看| 97人妻天天添夜夜摸| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产97色在线日韩免费| 少妇 在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 淫妇啪啪啪对白视频 | 日本wwww免费看| 国产一级毛片在线| 1024视频免费在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 成人三级做爰电影| 另类精品久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲成人免费电影在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久久久久久精品精品| 欧美黑人精品巨大| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲成国产人片在线观看| 久久九九热精品免费| 国产91精品成人一区二区三区 | 欧美日韩视频精品一区| 麻豆乱淫一区二区| 男女边摸边吃奶| 老司机在亚洲福利影院| 日本a在线网址| 一本大道久久a久久精品| 宅男免费午夜| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲国产精品一区三区| 咕卡用的链子| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产精品999| 性色av乱码一区二区三区2| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品 国内视频| 精品熟女少妇八av免费久了| svipshipincom国产片| 欧美乱码精品一区二区三区| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产精品成人久久小说| 老司机影院成人| 丰满少妇做爰视频| 无限看片的www在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 人人澡人人妻人| 久久久国产一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 日本wwww免费看| 黑丝袜美女国产一区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品久久久久久电影网| 超色免费av| 日韩有码中文字幕| 久久精品成人免费网站| 十八禁人妻一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 日本a在线网址| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品粉嫩美女一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产精品 国内视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产在线免费精品| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲三区欧美一区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 欧美成狂野欧美在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 不卡av一区二区三区| 中文字幕制服av| a级片在线免费高清观看视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 在线精品无人区一区二区三| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲中文av在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成年动漫av网址| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇精品久久久久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 自线自在国产av| 午夜视频精品福利| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美成人午夜精品| 99热全是精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 免费高清在线观看日韩| 午夜福利在线免费观看网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久国产成人免费| 国产精品一区二区免费欧美 | 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久精品人妻al黑| 黄色片一级片一级黄色片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 脱女人内裤的视频| 老司机在亚洲福利影院| 午夜福利,免费看| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 美女福利国产在线| 午夜激情久久久久久久| 操美女的视频在线观看| 麻豆av在线久日| 亚洲人成电影免费在线| 日韩有码中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品欧美一区二区三区在线| 水蜜桃什么品种好| 免费在线观看完整版高清| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲精品一区蜜桃| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产欧美在线一区| 丝袜脚勾引网站| 在线观看免费视频网站a站| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久国产一区二区| 脱女人内裤的视频| 999精品在线视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 一区在线观看完整版| 久久午夜综合久久蜜桃| 婷婷成人精品国产| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99热国产这里只有精品6| 免费在线观看日本一区| 美女视频免费永久观看网站| 高清视频免费观看一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久精品精品| 999精品在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 十八禁网站免费在线| 麻豆国产av国片精品| 日日夜夜操网爽| 亚洲全国av大片| 国产在线免费精品| 首页视频小说图片口味搜索| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久热这里只有精品99| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品久久蜜臀av无| 午夜两性在线视频| 亚洲久久久国产精品| 欧美精品一区二区免费开放| 久久99热这里只频精品6学生| 成人av一区二区三区在线看 | 一级,二级,三级黄色视频| 大片电影免费在线观看免费| 午夜两性在线视频| 免费高清在线观看日韩| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老司机在亚洲福利影院| 91精品三级在线观看| cao死你这个sao货| 女警被强在线播放| 大片免费播放器 马上看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 1024香蕉在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 12—13女人毛片做爰片一| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜成年电影在线免费观看| 制服人妻中文乱码| 性少妇av在线| 91麻豆av在线| 黄片播放在线免费| 久久国产精品人妻蜜桃| av国产精品久久久久影院| 窝窝影院91人妻| 国产亚洲av高清不卡| av天堂在线播放| 女人久久www免费人成看片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品av久久久久免费| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本av手机在线免费观看| 曰老女人黄片| 91字幕亚洲| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 满18在线观看网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 十八禁网站免费在线| 欧美精品一区二区大全| 日韩有码中文字幕| 高清av免费在线| 丰满少妇做爰视频| 热re99久久精品国产66热6| av在线app专区| 99re6热这里在线精品视频| 久久久久久久久久久久大奶| 久久这里只有精品19| 淫妇啪啪啪对白视频 | 精品亚洲成a人片在线观看| av视频免费观看在线观看| 天天添夜夜摸| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久热在线av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 一级片'在线观看视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一本综合久久免费| 老司机靠b影院| 国产又爽黄色视频| av有码第一页| 麻豆av在线久日| 操美女的视频在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲精品乱久久久久久| 色老头精品视频在线观看| 国产在线观看jvid| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲中文字幕日韩| 久热这里只有精品99| 免费高清在线观看视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 国产野战对白在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一级片'在线观看视频| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最黄视频免费看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 在线 av 中文字幕| 免费在线观看影片大全网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产在线观看jvid| 国产精品九九99| 超色免费av| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品人妻在线不人妻| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产区一区二久久| 国产av国产精品国产| 在线观看www视频免费| 国产在线观看jvid| 久久精品国产综合久久久| 九色亚洲精品在线播放| 日本五十路高清| 十八禁网站免费在线| 18在线观看网站| av网站在线播放免费| 精品久久久精品久久久| 999久久久国产精品视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人免费观看mmmm| 美女福利国产在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产野战对白在线观看| 女人久久www免费人成看片| 波多野结衣一区麻豆| 黄片播放在线免费| 亚洲熟女毛片儿| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲九九香蕉| 午夜老司机福利片| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲国产看品久久| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久久精品区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 老司机福利观看| 美女国产高潮福利片在线看| 久久毛片免费看一区二区三区| 久9热在线精品视频| 咕卡用的链子| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲专区中文字幕在线| 国产欧美亚洲国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日日爽夜夜爽网站| 嫩草影视91久久| 国产男女超爽视频在线观看| 国产麻豆69| 国产免费一区二区三区四区乱码| 嫩草影视91久久| 91成年电影在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 国产xxxxx性猛交| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产欧美在线一区| 无限看片的www在线观看| 日本五十路高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美日韩av久久| 国产在线观看jvid| 国产精品 国内视频| 黄色a级毛片大全视频| 久久精品国产a三级三级三级| 91av网站免费观看| 伦理电影免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜福利在线免费观看网站| 在线av久久热| 久热爱精品视频在线9| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美大码av| 国产在线一区二区三区精| 日韩欧美免费精品| 国产精品一区二区免费欧美 | 桃红色精品国产亚洲av| 欧美久久黑人一区二区| 自线自在国产av| 久久国产精品大桥未久av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| videosex国产| 国产亚洲欧美精品永久| 一二三四在线观看免费中文在| 久久中文看片网| 99热国产这里只有精品6| 一级毛片精品| 国产深夜福利视频在线观看| 大型av网站在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日韩欧美免费精品| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲熟女毛片儿| 久久久国产精品麻豆| 国产97色在线日韩免费| 国产亚洲av高清不卡| 久久国产精品大桥未久av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丰满饥渴人妻一区二区三| 色94色欧美一区二区| 91麻豆av在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久久国产成人免费| 欧美黄色淫秽网站| 午夜日韩欧美国产| 精品人妻1区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜免费鲁丝| 丝袜喷水一区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲欧美色中文字幕在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 一区二区三区乱码不卡18| 精品一区二区三卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美性长视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 视频区图区小说| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| www.自偷自拍.com| 香蕉丝袜av| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲精品在线美女| 黄频高清免费视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美精品一区二区大全| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产区一区二久久| 国产精品免费视频内射| 成人免费观看视频高清| 各种免费的搞黄视频| 日韩一区二区三区影片| 久久精品人人爽人人爽视色| 午夜成年电影在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 天天操日日干夜夜撸| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | e午夜精品久久久久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久水蜜桃国产精品网| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产av精品麻豆| 日韩大片免费观看网站| 999久久久精品免费观看国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| www.精华液| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品一区二区在线观看99| √禁漫天堂资源中文www| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲精品自拍成人| 男男h啪啪无遮挡| 国产淫语在线视频| 国产av又大| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 日韩免费高清中文字幕av| 嫩草影视91久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 波多野结衣一区麻豆| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 免费看十八禁软件| 中文字幕av电影在线播放| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一区二区三区av在线| a级毛片黄视频| 亚洲人成77777在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 丰满迷人的少妇在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品自拍成人| 欧美乱码精品一区二区三区| 深夜精品福利| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 91字幕亚洲| 国产成人影院久久av| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91字幕亚洲| 久久久国产成人免费| 在线观看www视频免费| 最近最新免费中文字幕在线| 女性被躁到高潮视频| 成年人免费黄色播放视频| 欧美精品av麻豆av| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 电影成人av| 久久精品国产综合久久久| 成年人免费黄色播放视频| 国产片内射在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 久9热在线精品视频| 999久久久国产精品视频| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美精品一区二区大全| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 黄色毛片三级朝国网站| 人妻一区二区av| 国产男女内射视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 永久免费av网站大全| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 一进一出抽搐动态| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91国产中文字幕| 少妇 在线观看| 国产精品.久久久| 大码成人一级视频| 91字幕亚洲| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久精品人妻al黑| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 99九九在线精品视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99九九在线精品视频| 男女免费视频国产| 99久久99久久久精品蜜桃| 一区福利在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 波多野结衣av一区二区av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩大片免费观看网站| 国产在线观看jvid| 十分钟在线观看高清视频www| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产高清视频在线播放一区 | 99久久99久久久精品蜜桃| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 91精品三级在线观看| 99国产精品99久久久久| 国产精品.久久久| 亚洲欧美一区二区三区久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 美女国产高潮福利片在线看| 日本五十路高清| 精品久久久久久电影网| 午夜福利视频在线观看免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品人妻在线不人妻| 高清在线国产一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 人妻久久中文字幕网| 精品一品国产午夜福利视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图|