基于靜息態(tài)功能磁共振的肌萎縮側(cè)索硬化癥大腦功能網(wǎng)絡(luò)研究

王倩楠，張靜娜，喬 梁，胡 俊，張 曄，王 莉，桑林瓊，李鵬岳，邱明國

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))：生物醫(yī)學(xué)工程與影像醫(yī)學(xué)系醫(yī)學(xué)圖像學(xué)教研室1，第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一組病因未知的異質(zhì)性致命性神經(jīng)退行性疾病，其特征是初級運(yùn)動皮質(zhì)、腦干和脊髓的上運(yùn)動神經(jīng)元和下運(yùn)動神經(jīng)元退行性病變。目前研究發(fā)現(xiàn)，ALS病變部位不局限于運(yùn)動區(qū)域，還涉及運(yùn)動外區(qū)域，可引起不同程度的認(rèn)知行為或自主神經(jīng)紊亂癥狀。目前ALS疾病主要依據(jù)臨床表征以及運(yùn)動神經(jīng)元電生理特性進(jìn)行診斷，由于ALS疾病表型顯示出高度的特異性，加上缺乏可靠的運(yùn)動神經(jīng)元生物標(biāo)志物，導(dǎo)致ALS診斷延遲(不完全表型約12個月甚至更長)，從而限制了對ALS患者進(jìn)行潛在神經(jīng)保護(hù)的早期治療方案。因此，尋找合適的非侵入式的生物標(biāo)記物來表征ALS疾病表型具有十分重要的臨床價值。

腦磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)已被證明在監(jiān)測ALS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性方面具有較好的應(yīng)用價值。本課題組在前期應(yīng)用結(jié)構(gòu)MRI研究發(fā)現(xiàn)，ALS患者右側(cè)BA4a區(qū)灰質(zhì)體積與修訂版ALS功能評分量表(revised ALS functional rating scale，ALSFRS-R)評分呈正相關(guān)。基于靜息態(tài)功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)的功能連接顯示其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)聯(lián)的潛在應(yīng)用前景，最近一項研究也發(fā)現(xiàn)ALS患者動態(tài)功能連接改變與運(yùn)動功能障礙嚴(yán)重程度相關(guān)。但目前該領(lǐng)域仍主要集中于運(yùn)動通路功能網(wǎng)絡(luò)，針對ALS患者大腦功能連接的整體特點及全腦功能網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦匝芯枯^少。

本研究通過構(gòu)建大腦大尺度功能網(wǎng)絡(luò)，基于圖論理論、橫斷面研究ALS患者與健康對照組功能網(wǎng)絡(luò)差異，并對ALS患者的功能拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)異常參數(shù)值與認(rèn)知及運(yùn)動功能的評分進(jìn)行相關(guān)分析，探討ALS患者靜息態(tài)fMRI功能腦網(wǎng)絡(luò)連接性損傷模式，以期為ALS早期診斷尋找客觀影像學(xué)標(biāo)記。

1 資料與方法

1.1 研究對象

招募2015年5月至2018年3月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診的25例ALS患者，其診斷符合世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟的修訂版EI Escorial診斷標(biāo)準(zhǔn)。ALS患者組男性13例，女性12例，年齡29～68(47.2±9.2)歲，病程為3～71個月。同時招募年齡、性別匹配的26例健康志愿者作為健康對照(healthy control, HC)組，其中男性19例，女性7例，年齡27～62(46.0±8.8)歲，以上被試均為右利手。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合修訂版EI Escorial診斷標(biāo)準(zhǔn)的ALS患者；患者在MRI掃描期間能夠仰臥。排除標(biāo)準(zhǔn)：有藥物或酒精依賴病史；高血壓、腦血管病及其他神經(jīng)系統(tǒng)病變相關(guān)疾??；磁共振檢查禁忌證。本研究通過陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批(KY202231)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床量表檢查評估

所有ALS患者由1名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生進(jìn)行3項臨床量表檢查：ALSFRS-R評價，評分總分從0(不能完成任務(wù))到40分(正常)；簡易精神狀態(tài)檢查(mini-mental state examination，MMSE)量表評價，MMSE量表總分30分，分?jǐn)?shù)在27～30分為正常，分?jǐn)?shù)<27為認(rèn)知功能障礙；蒙特利爾評估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)評價，MoCA量表總分30分，分?jǐn)?shù)在26～30分為正常，分?jǐn)?shù)<26為認(rèn)知功能障礙。

1.3 影像數(shù)據(jù)采集

使用德國西門子3.0T磁共振掃描儀器掃描大腦靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)。fMRI全腦快速成像EPI序列的掃描參數(shù)為：T

r

=2 000 ms，TE=30 ms，翻轉(zhuǎn)角度為90°，檢查視野(field of view，F(xiàn)OV)為192 mm×192 mm，36個橫斷層，層厚為3 mm，體素大?。? mm×3 mm×3 mm，共240個時間點。在患者進(jìn)入掃描室前，提前告知受試者平臥于掃描儀內(nèi)，閉上雙眼，不要睡覺，盡量不思考任何事情，保持不動。

1.4 靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)預(yù)處理

使用MRIcron軟件中的dcm2niigui軟件將所有DICOM數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為NIFTI格式，數(shù)據(jù)預(yù)處理采用基于MATLAB 2014a平臺的DPARSF軟件進(jìn)行處理(http://rfmri.org/DPARSF)。首先進(jìn)行時間層校正，共采集240個時間點，刪除每位被試數(shù)據(jù)的前10個時間點的數(shù)據(jù)，以得到剩余230個穩(wěn)定時間點的大腦信號；接著進(jìn)行頭動校正，把每位被試的每幀圖像與參考圖像(設(shè)為平均圖像)進(jìn)行剛性配準(zhǔn)，要求所有數(shù)據(jù)頭動不超過±2 mm 或者轉(zhuǎn)動在±2°范圍內(nèi)，若有超出范圍的則剔除該數(shù)據(jù)；然后進(jìn)行空間標(biāo)準(zhǔn)化，把功能fMRI數(shù)據(jù)配準(zhǔn)到高分辨率T1空間，再將T1圖像配準(zhǔn)至MNI空間的EPI模板，利用配準(zhǔn)參數(shù)文件將個體fMRI數(shù)據(jù)映射到MNI空間中，重采樣至3 mm×3 mm×3 mm的分辨率體素；最后進(jìn)行空間平滑：對所有fMRI圖像采用FWHM=8 mm平滑核進(jìn)行高斯平滑；進(jìn)行0.01～0.08 Hz帶通濾波，目的是對低頻基線漂移以及高頻生理信號的去除。最終獲得所有被試預(yù)處理后的MNI空間的時間序列數(shù)據(jù)。

1.5 功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及圖論分析

功能連接網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：按照自動解剖標(biāo)記(automated anatomical labeling，AAL)圖譜，將大腦皮層劃分為90個感興趣的解剖區(qū)域(region of interest，ROI)，這些解剖區(qū)域作為每位患者的大腦功能連接網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點。提取每個ROI中所有體素的時間序列并取平均值，以獲得每塊ROI的平均時間序列。針對每對ROI的平均時間序列進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，每個受試者產(chǎn)生90×90時間序列相關(guān)系數(shù)矩陣。使用Fisher’s Z變換將相關(guān)矩陣轉(zhuǎn)換為Z值，以改善相關(guān)系數(shù)的正態(tài)性。則此Z值即為每一條網(wǎng)絡(luò)的邊。

圖論分析：使用GRETNA toolbox(http://www.nitrc.org/projects/gretna/)探討整體和局部的功能網(wǎng)絡(luò)特征，功能網(wǎng)絡(luò)稀疏度選取范圍為10%～30%。對于全局指標(biāo)計算全局效率(global efficiency，E)、局部效率(local efficiency，E)、特征路徑長度(characteristic path length，L)、集聚系數(shù)(clustering coefficient，C)、標(biāo)準(zhǔn)化特征路徑長度(λ)和小世界組織參數(shù)(σ)。局部節(jié)點參數(shù)則計算節(jié)點效率(nodal efficiency，N)、節(jié)點度值(degree centrality，D)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對于人口統(tǒng)計學(xué)和神經(jīng)心理學(xué)測試，采用雙樣本

t

檢驗比較ALS組和HC組年齡差異，采用χ檢驗比較兩組間性別變量差異。通過GRETNA軟件，首先進(jìn)行基于網(wǎng)絡(luò)的統(tǒng)計分析(network-based statistics，NBS)，對兩組被試的全腦功能連接進(jìn)行組間差異分析；接著統(tǒng)計組間網(wǎng)絡(luò)參數(shù)(全局參數(shù)和節(jié)點參數(shù))之間差異，采用基于非參數(shù)置換檢驗(10 000次)方法，計算組間網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的統(tǒng)計顯著性，

P

<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將ALS患者組的功能拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)異常參數(shù)值(網(wǎng)絡(luò)連接發(fā)生改變的FC值、全局參數(shù)值、組間有差異腦區(qū)的節(jié)點參數(shù)值)分別與ALS患者的ALSFRS-R、MMSE、MoCA評分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，以雙側(cè)

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALS組和對照組人口統(tǒng)計學(xué)和神經(jīng)心理學(xué)資料比較

ALS患者組和HC組人口統(tǒng)計特征見表1。兩組間在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。

表1 ALS組和對照組間人口統(tǒng)計學(xué)和神經(jīng)心理學(xué)統(tǒng)計表

2.2 ALS組和對照組全腦功能連接比較

基于NBS方法，對ALS組和對照組的大腦功能連接進(jìn)行組間差異分析，將兩組間功能網(wǎng)絡(luò)的腦區(qū)連接異常改變的結(jié)果進(jìn)行顯示，通過MATLAB中BrainNet view軟件繪制圖畫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALS患者組在大腦前、后腦區(qū)之間功能連接出現(xiàn)廣泛增強(qiáng)改變，前扣帶回、額上回、額中回等腦區(qū)與楔葉、枕上回、枕中回、梭狀回等腦區(qū)之間功能連接顯著增強(qiáng)(圖1A)。ALS組的右側(cè)背外側(cè)前額葉與雙側(cè)中央旁小葉、左側(cè)顳極顳中回之間功能連接性降低，左側(cè)眶內(nèi)額下回-緣上回環(huán)路的功能連接亦顯著降低(圖1B)。

A：ALS組全腦的功能連接增強(qiáng)腦區(qū) 紅色線條示功能連接增強(qiáng); MFG：額中回；SFGmed：內(nèi)側(cè)額上回；ACG：前扣帶回；SOG：枕上回；SPG：頂上回；CUN：楔葉；MOG：枕中回；FFG：梭狀回；IPL：頂下緣角回；ANG：角回；B：ALS組全腦的功能連接降低腦區(qū) 藍(lán)色線條示功能連接降低; SMG：緣上回；PCUN：楔前葉；PCL：中央旁小葉；MTG：顳中回；SFGdor：背外側(cè)額上回；ORBmid：眶部額中回；ORBinf：眶部額下回

2.3 ALS組和對照組全局參數(shù)屬性比較

采用15%稀疏度下的網(wǎng)絡(luò)計算結(jié)果見表2，由網(wǎng)絡(luò)的小世界屬性的定義發(fā)現(xiàn)，兩組均存在小世界參數(shù)δ>1，表明兩個被試組的功能網(wǎng)絡(luò)均具有小世界組織特征。ALS患者標(biāo)準(zhǔn)化特征路徑長度λ較對照組顯著縮短(

P

<0.05)，其他參數(shù)組間未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 ALS組和對照組功能網(wǎng)絡(luò)全局參數(shù)差異

2.4 ALS組和對照組局部節(jié)點參數(shù)屬性比較

根據(jù)圖論理論計算ALS組和對照組的節(jié)點效率和節(jié)點度參數(shù)值，通過非參數(shù)置換檢驗方法計算兩組間網(wǎng)絡(luò)局部節(jié)點參數(shù)的差異，將兩組間局部節(jié)點參數(shù)值有差異的腦區(qū)結(jié)果進(jìn)行顯示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALS患者節(jié)點效率N主要集中在雙側(cè)額葉、左枕葉等腦區(qū)顯著增加，左后扣帶回節(jié)點效率降低(圖2)；左側(cè)額葉及尾狀核的節(jié)點度D顯著增加，但雙側(cè)后扣帶回、右側(cè)蒼白球的D顯著降低(圖3)。

顏色條示t值大?。杭t色代表ALS組節(jié)點效率增強(qiáng)的腦區(qū)；藍(lán)色代表ALS組節(jié)點效率降低的腦區(qū); SFGdor：背外側(cè)額上回；MFG：額中回；ORBmid：眶部額中回；SFGmed：內(nèi)側(cè)額上回；ACG：前扣帶回；PCG：后扣帶回；AMYG：杏仁核；SOG：枕上回；MOG：枕中回；CAU：尾狀核

顏色條表示t值大?。杭t色代表ALS組節(jié)點度增強(qiáng)的腦區(qū)；藍(lán)色代表ALS組節(jié)點度降低的腦區(qū)；SFGdor：背外側(cè)額上回；MFG：額中回；ACG：前扣帶回；PCG：后扣帶回；CAU：尾狀核；PAL：豆?fàn)钌n白球

2.5 相關(guān)分析結(jié)果

將大腦功能連接異常的FC值與臨床量表進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，左側(cè)眶內(nèi)額下回和緣上回功能連接FC值與ALSFRE-R評分呈正相關(guān)關(guān)系(

r

=0.512，

P

=0.008，圖4A)，即左側(cè)眶內(nèi)額下回和緣上回功能連接FC值越低，ALSFRE-R評分也越低。將有差異的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)值與臨床量表進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，左側(cè)枕中回節(jié)點效率與MoCA評分存在正相關(guān)趨勢關(guān)系(

r

=0.393，

P

=0.05，圖4B)，其他功能連接及網(wǎng)絡(luò)參數(shù)值與臨床量表評分之間未發(fā)現(xiàn)有顯著相關(guān)關(guān)系。

A：左側(cè)眶內(nèi)額下回和緣上回FC值與ALSFRE-R評分；B：左枕中回節(jié)點效率Ne與MoCA評分

3 討論

本研究采集靜息態(tài)fMRI影像數(shù)據(jù)并利用圖論理論分析和腦功能連接探索ALS患者大腦功能網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，發(fā)現(xiàn)ALS患者存在功能網(wǎng)絡(luò)連接性異常改變，大腦前、后腦區(qū)之間連接顯著增強(qiáng)。ALS組和對照組的大腦結(jié)構(gòu)均具有小世界特性，ALS患者大腦的最短路徑長度λ降低，應(yīng)用大腦功能網(wǎng)絡(luò)分析對了解ALS疾病相關(guān)運(yùn)動控制和認(rèn)知損害的神經(jīng)機(jī)制具有重要意義。

3.1 ALS患者功能網(wǎng)絡(luò)連接變化特點

多項靜息態(tài)fMRI研究證實，ALS患者在大腦調(diào)節(jié)特定行為和認(rèn)知功能的網(wǎng)絡(luò)內(nèi)存在功能連接增加的改變，額顳葉神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能連接增強(qiáng)且與執(zhí)行功能障礙有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)ALS患者額葉與頂葉、顳葉及枕葉之間連接顯著增強(qiáng)，認(rèn)為大腦前、后腦區(qū)之間功能連接增加可能有助于克服額葉和頂葉結(jié)構(gòu)損傷引起的功能障礙。已有研究發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域是結(jié)構(gòu)連接中斷的一部分，結(jié)構(gòu)連接降低可在5.5個月的時間里從初級運(yùn)動區(qū)擴(kuò)展到額葉和頂葉區(qū)域。ALS患者胼胝體損傷可導(dǎo)致抑制性GABA能中間神經(jīng)元的丟失，經(jīng)胼胝體抑制作用減弱從而導(dǎo)致前、后腦區(qū)間功能連接增強(qiáng)。最近一項多中心研究也證實，ALS中存在廣泛的運(yùn)動/運(yùn)動外腦結(jié)構(gòu)及功能網(wǎng)絡(luò)變性，表明圖論分析和連接組學(xué)可能是檢測ALS運(yùn)動神經(jīng)元變性、運(yùn)動/運(yùn)動外腦區(qū)功能改變和網(wǎng)絡(luò)重組的有力工具。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ALS患者運(yùn)動網(wǎng)絡(luò)右側(cè)背外側(cè)前額葉與雙側(cè)中央旁小葉、左側(cè)顳極顳中回之間功能連接性顯著降低，左側(cè)眶內(nèi)額上回-緣上回功能連接也顯著降低。ZHOU等報道了12例ALS患者與健康對照者的運(yùn)動網(wǎng)絡(luò)連通性，發(fā)現(xiàn)初級運(yùn)動皮質(zhì)和運(yùn)動前皮質(zhì)存在連接性降低。背外側(cè)前額葉作為額葉重要腦功能區(qū)，其在工作記憶、注意力調(diào)控、認(rèn)知控制、連接認(rèn)知和動作中起到重要作用。中央旁小葉位于中央前、后回折入內(nèi)側(cè)面的部分，與對側(cè)小腿和足的運(yùn)動、感覺有關(guān)。ALS患者背外側(cè)前額葉與運(yùn)動相關(guān)皮層中央旁小葉間功能連接值降低，表明其認(rèn)知控制、運(yùn)動感覺功能受到損害。本研究相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ALS患者左側(cè)眶內(nèi)額上回-緣上回功能連接值與ALSFRS-R評分呈顯著正相關(guān)，即眶額葉與緣上回功能連接值越低，疾病的嚴(yán)重程度越重。此前也有研究發(fā)現(xiàn)在肢體先發(fā)病的ALS患者中，左側(cè)眶額葉與ALSFRS-R相關(guān)。眶額葉在情緒控制等高級腦功能和復(fù)雜行為執(zhí)行中有重要作用，參與記憶或行為決策功能；緣上回與語言表達(dá)和處理等功能相關(guān)，主要涉及語言感知和加工?？魞?nèi)額下回和緣上回功能連接降低提示情緒控制功能與語言表達(dá)處理功能之間的轉(zhuǎn)換出現(xiàn)異常。本研究發(fā)現(xiàn)大腦功能連接降低改變和相關(guān)性結(jié)果可能對預(yù)測ALS疾病診斷有用，左側(cè)眶內(nèi)額上回-緣上回功能連接值可作為一種影像學(xué)標(biāo)記物，對于疾病的診斷及預(yù)后評估具有一定的參考意義。

3.2 ALS患者功能網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)變化特點

大腦大尺度連接的網(wǎng)絡(luò)研究能揭示促進(jìn)神經(jīng)信息分離和整合的特性，本研究發(fā)現(xiàn)ALS患者和HC組大腦均具有小世界組織特性，與之前對ALS患者的圖論研究結(jié)果基本一致，表明人腦支持在涉及認(rèn)知、感覺和運(yùn)動處理的分離的大腦區(qū)域之間整合信息，以賦予抵抗病理損傷的能力，并以最小的成本最大限度地提高不同大腦區(qū)域之間的信息處理效率。盡管在ALS患者和HC組中具有小世界組織，但兩組被試在功能連接網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦陨洗嬖谝恍┎町?，本研究發(fā)現(xiàn)ALS患者大腦的標(biāo)準(zhǔn)化特征路徑長度降低。標(biāo)準(zhǔn)化特征路徑長度可反映大腦中信息傳輸?shù)哪芰Γ竽X網(wǎng)絡(luò)中遠(yuǎn)距離腦區(qū)之間的最短路徑可確保信息的有效整合和快速傳輸。本研究顯示，ALS患者功能連接網(wǎng)絡(luò)的全局特性改變可能通過完整區(qū)域的代償功能連接在相對較短的時間內(nèi)達(dá)到正常水平，表明ALS患者的信息整合和神經(jīng)元長距離傳輸信息的能力在短期內(nèi)可能有所提高。

本研究在分析ALS患者功能網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦詴r發(fā)現(xiàn)在13個節(jié)點的節(jié)點效率顯著增加，主要位于視覺-認(rèn)知網(wǎng)絡(luò)的大腦區(qū)域，包括左側(cè)枕中回、左側(cè)枕上回、雙側(cè)額中回、雙側(cè)背外側(cè)額上回、左側(cè)眶額皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)等，與本研究ALS患者功能網(wǎng)絡(luò)連接增加的腦區(qū)基本一致。這些腦區(qū)的節(jié)點效率增強(qiáng)、腦區(qū)功能連接增加，可能是因為在結(jié)構(gòu)損傷的情況下，需要這些腦區(qū)更高效地對其結(jié)構(gòu)損傷帶來的功能異常進(jìn)行補(bǔ)償，但當(dāng)ALS病理負(fù)擔(dān)增加到一定程度時，這種補(bǔ)償可能會耗盡，從而表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)在左枕中回節(jié)點效率與MoCA評分存在正相關(guān)趨勢，即ALS患者認(rèn)知功能評分越高，左側(cè)枕中回節(jié)點效率增加越多，視覺皮層節(jié)點效率增加對ALS患者運(yùn)動功能障礙起到一定的代償作用。本研究還發(fā)現(xiàn)左側(cè)后扣帶回節(jié)點效率降低、雙側(cè)后扣帶回節(jié)點度降低，表明后扣帶回節(jié)點與其他所有腦節(jié)點之間信息傳遞效率降低。研究顯示大腦中央前回與后扣帶回之間存在顯著連通性，后扣帶回在運(yùn)動相關(guān)網(wǎng)絡(luò)重組具有重要作用，本研究結(jié)果提示后扣帶回可能是ALS患者運(yùn)動功能障礙的一個關(guān)鍵區(qū)域。

3.3 小結(jié)與研究局限

本研究提供了一個新的視角來了解功能網(wǎng)絡(luò)破壞對ALS的早期運(yùn)動及認(rèn)知損害的神經(jīng)病理學(xué)影響。本研究還存在一定的局限性。首先，本研究是樣本量相對較小的橫斷面研究，未來需要更大樣本量的縱向研究來檢測功能網(wǎng)絡(luò)特性的動態(tài)變化。其次，本研究只關(guān)注ALS患者功能網(wǎng)絡(luò)特性與其神經(jīng)生理學(xué)測試的關(guān)系，下一步還需探索功能網(wǎng)絡(luò)和結(jié)構(gòu)連接之間的重疊以獲得更令人信服和可靠的結(jié)果。