苦瓜籽蛋白的PEG/(NH4)2SO4雙水相分離及抑菌作用的研究

蔡 馬，于 群，朱新產(chǎn)*

1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣州510225;2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島266109

苦瓜(Momordica charantia L.)已有數(shù)百年食用和藥用歷史［1］。臨床實(shí)驗(yàn)研究表明苦瓜中存在多種有效藥用活性成分。從苦瓜籽中分離出的MAP30是堿性糖蛋白質(zhì)，具有RNA N-糖苷酶活力的生物毒性，也破壞DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)活性，特異地作用于病毒DNA影響其復(fù)制表達(dá)，既可以作為研究核糖體RNA結(jié)構(gòu)與功能的工具酶，又能將MAP30與單抗耦聯(lián)后形成“免疫毒素”［2］?？喙现写嬖陬愐葝u素樣肽，給正常沙鼠、猴及糖尿病患者注射有降低血糖作用，口服同樣有效［3］。用一種非完全純苦瓜蛋白注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)抗體標(biāo)記的部分癌細(xì)胞被殺傷，同時(shí)還具有抗白血病和抗病毒的作用［4］。苦瓜素抑制兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)合成的活性等［5］。此外，苦瓜還有較強(qiáng)的抗氧化作用［6］。苦瓜提取物(MCE)更具廣譜的殺菌作用［7］，苦瓜籽粗蛋白對(duì)部分植物病原細(xì)菌有抑菌活性?？喙系牟煌钚猿煞謱?duì)致病細(xì)菌和植物病原細(xì)菌的抑菌作用有選擇性，但其活性成分的分離成為苦瓜開(kāi)發(fā)和利用的瓶頸。大多苦瓜抑菌的研究均集中在葉、果汁上，對(duì)苦瓜籽蛋白的研究較少，故此研究苦瓜籽蛋白的有效分離技術(shù)及抗菌活性，試圖探究苦瓜籽蛋白獨(dú)特的藥理性作用及其分子作用機(jī)制，開(kāi)創(chuàng)苦瓜自然有效資源及其在醫(yī)學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)研究中應(yīng)用的新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 苦瓜品種

油苦瓜籽粒，由壽光試驗(yàn)基地提供。將苦瓜籽外殼剝?nèi)ズ螅心コ煞勰?，用乙醚浸泡脫脂，風(fēng)干冷藏備用。

1.1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門(mén)氏菌(salmonella)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、紅酵母(Rhodotorula sp)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌)、麥芽汁培養(yǎng)基(酵母菌)、馬鈴薯培養(yǎng)基(霉菌)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 建立雙水相萃取體系

分別固定PEG6000和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，pH值為 7.0，不添加無(wú)機(jī)鹽，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4和PEG6000組成雙水相體系［8，9］，取3 g脫脂苦瓜籽粉溶于雙水相之中，4℃攪拌萃取4 h，測(cè)定蛋白質(zhì)的分配系數(shù)、相比及萃取率。相關(guān)計(jì)算公式為:分配系數(shù)K=Ct/Cb;相比R=Vt/Vb;回收率(Y%)Yt=上相總酶活/上下相總酶活=CtVt/ (CtVt+CbVb);Yb=下相總酶活/上下相總酶活= CbVb/(CtVt+CbVb);式中:Ct、Cb:分別代表上、下相酶活力;Vt、Vb:分別代表上、下相體積。

1.2.2 苦瓜籽蛋白的分離

采用確定的雙水相體系萃取苦瓜蛋白，經(jīng)離心、透析，用PEG6000包埋濃縮，冷凍備用。

1.2.3 苦瓜籽蛋白

SDS-PAGE參照文獻(xiàn)［10］的方法，用SDS緩沖液(0.22 M Tris-HCl pH6.8，3%SDS，10%甘油)按1∶1稀釋苦瓜粗蛋白樣品，沸水浴提取3 min，10000 rpm離心 10 min，上清液用于電泳分析。分離膠12.5%，濃縮膠2.5%，在室溫恒流25 mA條件下，電泳約6 h。標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker為MBI SM0431。

1.2.4 凝膠染色顯帶

用0.12%CBB R250，乙醇-乙酸(25%～8%)溶液對(duì)SDS-PAGE膠片染色8～10 h，乙醇-乙酸(20%～7%)溶液脫色至背景清晰，透射光下成像相記錄。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的logMW對(duì)相對(duì)遷移率作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)電泳結(jié)果，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相對(duì)分子量。

1.2.5 苦瓜籽蛋白的抑菌試驗(yàn)

用無(wú)菌吸管吸取0.1 mL菌懸液于無(wú)菌平皿中，加入已滅菌的冷卻至45℃的培養(yǎng)基15 mL，混勻后水平放置。因供試菌種的不同，所采用的培養(yǎng)基也不同。用直徑6 mm的瓊脂打孔器均勻打孔，每板6孔，去除孔內(nèi)瓊脂并適當(dāng)封閉孔底。將供試苦瓜蛋白液加于孔，每孔15 μL。置4℃冰箱中作用1 h后取出并置于恒溫箱中培養(yǎng)，細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24 h，真菌27℃下培養(yǎng)48 h。取出后，測(cè)定其抑菌圈直徑，取其平均值。

1.2.6 苦瓜籽蛋白最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［11］等的方法，用苯甲酸鈉做對(duì)比，濃度為200 mg/mL，并以無(wú)菌水做對(duì)照，將培養(yǎng)后的培養(yǎng)物與空白對(duì)照比色測(cè)定，若二者OD值完全相同，即培養(yǎng)基中完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為苦瓜蛋白的最低抑菌濃度。

1.2.7 苦瓜籽蛋白的穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用大腸桿菌試驗(yàn)菌種，測(cè)定不同鹽離子濃度、溫度、pH、紫外線殺菌及低溫冷藏時(shí)間等因素對(duì)苦瓜蛋白抑菌功能的影響。(1)無(wú)機(jī)鹽NaCl濃度為: 0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%和6.4%，浸泡純化苦瓜蛋白2 h;(2)溫度設(shè)置為:4、24、44、64、84、104℃和124℃，分別處理10 min;(3)pH為:3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;(4)紫外光下照射時(shí)間為:5，10，15，20 min和25 min;(5)低溫(–20℃)儲(chǔ)藏時(shí)間:5、10、15、20、25、30、35 d和40 d;調(diào)節(jié)濃度5 mg/mL，分別測(cè)定抑菌效果。

1.2.8 苦瓜籽蛋白的抗氧化作用

清除羥自由基能力測(cè)定，參考文獻(xiàn)［12］，·OH清除率(%)=(A1–Ax)/A1×100%，A1——空白對(duì)照液的吸光度;Ax——加入純化苦瓜蛋白后的吸光度。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

用 Quantity One/BandScan5.0軟件對(duì) SDSPAGE凝膠中的每一條帶進(jìn)行標(biāo)記、掃描分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配系數(shù)和回收率的影響

表1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦瓜籽蛋白萃取的影響Table 1 Mass fraction of ammonium sulfate to suffer the effects of Momordia seeds protein extraction

從表1可以看出，當(dāng) PEG6000的量固定時(shí)，在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的范圍內(nèi)，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)Kp下降，回收率Yp%在逐漸上升。當(dāng)(NH4)2SO4濃度超過(guò)一定范圍(26.0%)時(shí)，Kp又逐漸上升，Yp%逐漸下降。總體趨勢(shì)中，相比R在下降。綜合考慮，確定(NH4)2SO4的的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%。

2.2 PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配系數(shù)和回收率的影響

表2 PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦瓜籽蛋白萃取的影響Table 2 Mass fraction of polyethylene glycol to suffer the effects of Momordia seeds protein extraction

表2表明，隨著PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，Kp先下降后上升，Yp先增大后減小，并且在PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.0%時(shí)，Kp和Yp都達(dá)到最佳值?？傮w趨勢(shì)下，R值隨PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，即下相體積越來(lái)越小，上相體積越來(lái)越多。蛋白質(zhì)的分配系數(shù)變化較大，而回收率變化較小。因此確定PEG6000質(zhì)量最佳分?jǐn)?shù)為22.0%。

2.3 雙水相分離苦瓜籽蛋白的SDS-PAGE鑒定分析

雙水相分離的苦瓜籽蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳(圖1，表3)，在非還原條件下(–Mer)，出現(xiàn)了22條蛋白帶，其主要蛋白質(zhì)組分分子量較高，大于35 kD。而在還原條件下(+Mer)，顯示了12條蛋白帶，其主要蛋白質(zhì)組分在低分子量區(qū)，小于35 kD。表明苦瓜籽蛋白中存在較多二硫鍵。

表3 雙水相分離苦瓜籽粒蛋白的SDS-PAGE掃描分析參數(shù)Table 3 Scanning parameters of the SDS-PAGE of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

28 442 6.07 4041 1.1 29 456 6.77 9977 3.3 30 471 6.29 6473 1.1 465 6.98 6643 8.6 469 7.00 6014 13.6 31 507 7.44 11048 24.9 32 529 6.62 6711 3.8 33 534 7.58 12766 21.3

2.4 雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌性試驗(yàn)

體外抑菌試驗(yàn)顯示雙水相分離的苦瓜籽蛋白(P)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、紅酵母、黃曲霉和黑曲霉產(chǎn)生明顯的抑菌圈(圖2)，表明雙水相分離的苦瓜籽蛋白對(duì)細(xì)菌和真菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，是一種廣譜抗菌蛋白。

圖2 雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性Fig.2 The antimicrobial activities of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

2.5 雙水相分離苦瓜籽蛋白的穩(wěn)定性

通過(guò)大腸桿菌抑菌試驗(yàn)，檢測(cè)不同鹽離子濃度、溫度、pH及紫外線等因素條件對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白(5 mg/mL)抑菌活性的影響，顯示雙水相分離苦瓜籽蛋白具有較好的穩(wěn)定性。

2.5.1 無(wú)機(jī)鹽對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖3顯示，在NaCL濃度低于0.8%時(shí)，鹽離子對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性沒(méi)有影響。當(dāng)NaCL濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，隨著鹽離子質(zhì)量濃度的增大，抑菌活性有下降的趨勢(shì)，抑菌圈直徑變小。在鹽離子濃度較低時(shí)其抑菌活性較強(qiáng)，說(shuō)明純化苦瓜蛋白在低鹽食品中的抑菌效果較好。

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.3 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase in NaCl of different concentration

2.5.2 溫度對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖4顯示，當(dāng)溫度低于44℃時(shí)對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性沒(méi)有影響。當(dāng)溫度上升至64℃時(shí)，雙水相分離苦瓜籽蛋白經(jīng)不同溫度處理后抑菌活性有所變化;當(dāng)溫度為4～44℃時(shí)，其抑菌活性基本保持不變，但當(dāng)溫度升高至64℃，抑菌圈直徑變小，抑菌活性呈下降趨勢(shì);到84℃和104℃時(shí)，抑菌活性分別下降56%和82%;124℃時(shí)則完全失活。高溫可能使苦瓜蛋白變性，喪失抑菌活性。

圖4 溫度對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.4 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase at different temperature

2.5.3 pH對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖5顯示，隨著pH的升高，雙水相分離苦瓜籽蛋白對(duì)菌體的抑制能力有下降的趨勢(shì)。在酸性條件下(pH＜7)，雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性增強(qiáng)，其抑菌圈直徑增大;堿性條件下(pH＞7)，純化苦瓜蛋白抑菌活性轉(zhuǎn)弱，抑菌圈直徑減小。在pH6～7之間，緩沖液對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性沒(méi)有影響，并且其抑菌效果較好。

圖5 pH對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.5 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase at different pH

2.5.4 紫外光對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖6顯示，隨著紫外光對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌活性基本保持不變，抑菌圈直徑?jīng)]有明顯變化。提示雙水相分離苦瓜籽蛋白對(duì)紫外光具有較高的穩(wěn)定性。

圖6 紫外光對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.6 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase on ultraviolet

2.5.5 低溫儲(chǔ)藏對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖7顯示，雙水相分離苦瓜籽蛋白在低溫下抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定，在15 d內(nèi)抑菌活性沒(méi)有明顯變化;15 d后其活性呈下降趨勢(shì)，但仍具有相當(dāng)?shù)囊志钚浴?/p>

圖7 低溫儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.7 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase in refriqerant time

2.6 雙水相分離苦瓜籽蛋白的最低抑菌濃度(MIC)

比濁法測(cè)定雙水相分離苦瓜籽蛋白的最低抑菌濃度結(jié)果顯示(表4):雙水相分離苦瓜籽蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC低于0.2 mg/mL;對(duì)酵母菌的MIC低于0.4 mg/mL，對(duì)黃曲霉的MIC低于1.6 mg/mL。

2.7 雙水相分離苦瓜籽蛋白的清除羥自由基能力

圖8顯示，雙水相分離苦瓜籽蛋白的清除羥自由基能力。隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，雙水相分離苦瓜籽蛋白的抗氧化能力呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，其作用能力低于相同濃度下的抗壞血酸。

表4 雙水相分離苦瓜籽蛋白的最低抑菌濃度Table 4 The MIC value of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

圖8 雙水相分離的苦瓜籽蛋白對(duì)·OH自由基的清除率Fig.8 Clearance on·OH free radical activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase

3 討論

當(dāng)體系中只有PEG沒(méi)有(NH4)2SO4時(shí)，體系不形成雙水相;當(dāng)鹽濃度增加到一定量后雙水相形成。蛋白質(zhì)分配系數(shù)小于1，表明蛋白主要分配在下相［13］。(NH4)2SO4用量不同，上下相電位差不同，而電位差的大小直接影響到分配系數(shù)和萃取率，而且硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)愈高，會(huì)破壞酶表面的水化層，則使蛋白發(fā)生鹽析，使蛋白的萃取率下降。另外，鹽濃度過(guò)高不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比［14］。依據(jù)分配理論，隨著聚乙二醇增加，黏度增大，阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加，相界面張力亦增加。當(dāng)PEG用量較低時(shí)，(NH4)2SO4的鹽析作用起主要作用，使蛋白質(zhì)主要分布在下相中。增大PEG含量，相比增加，上下相熱力學(xué)特征差異更大，不同物質(zhì)分配系數(shù)之間的差別也會(huì)增大［15］。本試驗(yàn)表明分離苦瓜籽蛋白的雙水相系統(tǒng)中 PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、鹽離子濃度等均不相同，其最適的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)是25%，最適的PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)是22%，分配系數(shù)K＜0.1，蛋白回收率Y%大于95%，由于大多數(shù)的蛋白質(zhì)為中性蛋白，因此調(diào)節(jié)pH在6.95～7.05之間。

蛋白質(zhì)的氨基酸組成、序列、立體構(gòu)象及生物學(xué)功能與其它生物分子混合物的理化性質(zhì)存在著較大差異，從而使得從成千上萬(wàn)種復(fù)雜混合物中分離出蛋白成為可能。本試驗(yàn)利用雙水相技術(shù)，針對(duì)苦瓜籽蛋白設(shè)計(jì)合理特異的分離策略，分離出苦瓜籽蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳顯示(圖1)，苦瓜籽蛋白質(zhì)主要是50 KD、43 KD和10 KD亞基結(jié)合形成的多聚體12S(327 KD)球蛋白，還原條件下出現(xiàn)諸多小于35 kD的蛋白組分。表明蛋白質(zhì)亞基是通過(guò)二硫鍵結(jié)合。

植物粗提物對(duì)霉菌和酵母菌一般沒(méi)有抑制作用，將粗提物提純后所得的較純物質(zhì)可能對(duì)其具有一定的抑制作用［7，16］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙水相分離出的苦瓜籽蛋白，對(duì)受試細(xì)菌菌和真菌產(chǎn)生明顯的抑菌活性(圖2)，其MIC遠(yuǎn)低于苯甲酸鈉，苯甲酸鈉對(duì)細(xì)菌的MIC遠(yuǎn)高于苦瓜蛋白，約大于1000 mg/mL，但其對(duì)霉菌和真菌的MIC為250 mg/mL［17］。提示雙水相分離的苦瓜籽蛋白是一種廣譜型高活性抗菌蛋白。

苦瓜對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌和革蘭氏陰性桿菌具有良好的抑殺菌效果［18］，而且苦瓜原液和苦瓜提取液能有效地延遲肉類食品的腐敗變質(zhì)和降低其細(xì)菌總數(shù)。此外，苦瓜還有良好的抗氧化作用，除維生素C、E，苦瓜皂苷也具有抗氧化作用［6］。本試驗(yàn)表明，雙水相分離的苦瓜籽蛋白具有較強(qiáng)的清除羥自由基能力和總抗氧化能力(圖8)，僅略低于相同濃度下的抗壞血酸。提示雙水相分離的苦瓜籽蛋白是一種抗氧化性較強(qiáng)的蛋白，其顯著的廣譜抗菌活性和抗氧化能力，為化學(xué)組成固定、生物反應(yīng)明確及無(wú)安全性顧慮的苦瓜功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

雙水相分離的苦瓜籽蛋白對(duì)供試細(xì)菌、真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，而且在不同鹽離子濃度、溫度、pH及紫外線等因素處理時(shí)，均具有一定的穩(wěn)定性(圖3～7)。但雙水相分離苦瓜籽蛋白熱穩(wěn)定性較差，64℃以后隨著溫度的上升抑菌活性呈加速下降趨勢(shì)，124℃則完全失活。然而，苦瓜葉原液加熱后抑菌活性基本沒(méi)有變化［19］，推測(cè)原因可能是苦瓜葉中的抑菌成分對(duì)熱不敏感，可能含有一些非蛋白類成分;隨著pH的升高，雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性有下降趨勢(shì)，pH為3、5時(shí)其對(duì)供試菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)照(pH7.0)，可能因?yàn)樗嵝暂^強(qiáng)的緩沖液對(duì)實(shí)驗(yàn)菌有微弱的抑制作用，或與其性質(zhì)有關(guān);低鹽離子濃度較時(shí)抑菌活性較強(qiáng)，大于0.8 mg/mL濃度的無(wú)機(jī)鹽影響雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性，可能是因?yàn)楫a(chǎn)生了鹽析現(xiàn)象而導(dǎo)致少量蛋白失活，或者鹽的滲透壓升高而受影響;雙水相分離苦瓜籽蛋白對(duì)低溫儲(chǔ)藏時(shí)間及紫外線照射不敏感，低溫下不易失活，且具有光穩(wěn)定性。因此，雙水相分離的苦瓜籽蛋白作為一種天然防腐劑及食品添加劑具有良好的加工性能。

1 Xiang YL(向亞林)，Ling B(凌冰)，Zhang MX(張茂新).Research advances in the chmical and biological studies on Momordica charantia L..Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2005，17:142-246.

2 Puri M，Kaur I，Kanwar RK，et al.Ribosome inactivating proteins(RIPs)from Momordica charantia for anti viral therapy.Curr Mol Med，2009，9:1080-1094.

3 Ooi CP，Yassin Z，Hamid TA.Momordica charantia for type 2 diabetes mellitus.Cochrane Database Syst Rev，2010，17(2): CD007845.

4 Cunnick JE，Sakamoto K，Chapes SK，et al.Induction of tumor cytotoxic immune cells using a protein from the bitter melon(Momordica charantia).Cell Immunol，1990，126: 278-289.

5 Abd EI Sattar EI Batran S，EI-Gengaihi SE，EI Shabrawy OA.Some toxicological studies of Momordica charantia L.on albino rats in normal and alloxan diabetic rats.J Ethnopharmacol，2006，108:236-242.

6 Sathishsekar D，Subramanian S.Antioxidant properties of Momordica charantia(bitter gourd)seeds on Streptozotocin induced diabetic rats.Asia Pac J Clin Nutr，2005，14:153-158.

7 Horax R，Hettiarachchy N，Over K，et al.Extraction fractionation and characterization of bitter melon seed proteins.J Agric Food Chem，2010，58:1892-1897.

8 Imelio N，Marini A，Spelzini D，et al.Pepsin extraction from bovine stomach using aqueous two-phase systems:molecular mechanism and influence of homogenate mass and phase volume ratio.J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci，2008，873(2):133-138.

9Huang SX(黃淑霞)，Wu XL(吳曉莉)，Yin ZR(尹卓容).Extraction and purification of saccharifying enzymes by PEG/ (NH4)2SO4double aqueous phases system.Liquor-Making Sci Technol(釀酒科技)，2003，2:24-25.

10 Zhu XC(朱新產(chǎn))，Liao XR(廖祥儒)，Jie MH(頡敏華)，et al.Study on Momordica charantia L.proteins and functions.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，1998，10:41-44.

11 Yao SM.Study on antimicrobial action of Aloe extracts.Food Sci，2002，23:137-139.

12 Zhan YP.In vitro studies on the free radical scavenging capacity of extract from Perilla frutescens.Sci Technol Food Ind，2003，24(10):67-70.

13 Gao JJ，Li H，Zhang Y.A non-phosgene route for synthesis of methyl N-phenyl carbamate from dimethyl carbonate and N，N'-diphenyl derived from CO2.Green Chem，2007，9:572-576.

14 Zhou HH(周紅航)，Wang WX(王維香).Separation of porcine pancreatic trypsin using aqueous two-phase systems.Chem Ind Eng Prog(化工進(jìn)展)，2009，28:305-315.

15 Zheng N(鄭楠)，Liu J(劉杰).Study on partition and purification of protein by aqueous two-phase technology.Chem Bioeng(化學(xué)與生物工程)，2006，23(10):7-9.

16 Zhao SL，Chen CY，Duan JG.The bacteriostatic activity of the extracts from Cactus.Sci Technol Food Ind，2003，5:40-43.

17 Omoregbe RE，Ikuebe OM，Ihimire IG.Antimicrobial activity of some medicinal plants extracts on Escherichia coli，Salmonella paratyphi and Shigella dysenteriae.Afr J Med Med Sci，1996，25:373-375.

18 Zhang XZ，Chen QS，Cheng GW.Studies on inhibiting-bacteria of Momordica charantia.J Prev Med Inform，1996，12:17-20.

19 Pitchakarn P，Ogawa K，Suzuki S，et al.Momordica charantia leaf extract suppresses rat prostate cancer progression in vitro and in vivo.Cancer Sci，2010，101:2234-2240.