光合細(xì)菌對2,4,6-三氯苯酚的降解特性研究

姚 斌,金贊芳,胡忠策,金 瓊,潘志彥 (浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310032)

光合細(xì)菌對2,4,6-三氯苯酚的降解特性研究

姚 斌,金贊芳,胡忠策,金 瓊,潘志彥*(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310032)

研究了混合光合細(xì)菌PSB-DR在不同光照、接種量和pH值下對2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)的生物降解特性,確定了PSB-DR生物降解 2,4,6-TCP的優(yōu)化控制條件.結(jié)果表明,光照培養(yǎng)下,接種量 30%,初始 pH值 7.0時 2,4,6-TCP降解效率最高.在此條件下,50mg/L的2,4,6-TCP經(jīng)5d后降解率達(dá)到82.3%.培養(yǎng)基中醋酸鈉的加入對2,4,6-TCP降解有明顯的抑制作用.PSB-DR靜息細(xì)胞對2,4,6-TCP的降解符合高濃度底物抑制的酶促反應(yīng)類型,其降解動力學(xué)參數(shù)rmax=1.746h-1,Km=38.333mg/L,Ki=260.87mg/L.

光合細(xì)菌；生物降解；2,4,6-三氯苯酚；降解動力學(xué)

氯酚類化合物廣泛存在于石油化工、農(nóng)藥、造紙等行業(yè)的廢水中.2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)由于酚環(huán)結(jié)構(gòu)上連有 3個氯原子而成為毒性最強(qiáng)的氯酚類化合物之一,具有較強(qiáng)的“三致”作用,能夠以水為載體廣泛地擴(kuò)散,已被美國環(huán)境保護(hù)局列為“優(yōu)先控制污染物”,我國也將其列入68種優(yōu)先污染物的“黑名單”[1].

2,4,6-TCP的生物降解一直是國內(nèi)外研究的一個重要課題,已有學(xué)者從受其污染的水體、土壤中發(fā)現(xiàn)并分離出了能夠降解 2,4,6-TCP的微生物[2-6],但卻鮮有關(guān)于光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria,簡稱 PSB)降解 2,4,6-TCP的報道.PSB是具有原始光能合成體系的原核生物,在不同的環(huán)境中,PSB會表現(xiàn)出多種代謝途徑,能在厭氧光照、好氧光照、好氧黑暗等條件下利用低分子有機(jī)物.因此,PSB在有機(jī)廢水的處理及生物修復(fù)中得到廣泛的應(yīng)用[7-10].

近年來,隨著人類活動范圍的擴(kuò)大,受2,4,6-TCP污染的貧營養(yǎng)水體可能會存在微生物生長所需的氮、磷及生長因子不足等問題,從而使細(xì)胞難以增殖.本文采用混合光合細(xì)菌靜息細(xì)胞(即不生長的細(xì)胞)在低營養(yǎng)條件下降解2,4,6-TCP,研究生化反應(yīng)的影響因素,尋求快速降解 2,4,6-TCP的工藝條件,以期為工程上降解2,4,6-TCP及其生物修復(fù)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

混合光合細(xì)菌PSB-DR種子液購自浙江鼎龍集團(tuán)已產(chǎn)業(yè)化的商品菌種,其優(yōu)勢菌群為紅假單胞菌.

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:以光合細(xì)菌典型的生長氮源氯化銨作為培養(yǎng)的氮源,以醋酸鈉作為培養(yǎng)的碳源.具體成分如下:CH3COONa 2.4g,NH4Cl 0.65g, K2HPO41.55g, KH2PO40.65g,大量金屬元素MgSO4·7H2O 0.2g, CaCl20.059g, FeSO4·7H2O 0.012g,微量元素混合液[Cu(NO3)240mg/L, Na2MoO476mg/L,MnSO4160mg/L,Zn(NO3)224mg/L]1mL,生長因子包括泛酸1.0×10-3g, 維生素B1 1.0×10-3g,生物素1.0×10-5g,蒸餾水1L, pH值6.8～7.0.降解培養(yǎng)基:只含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的3種大量金屬元素,以維持靜息細(xì)胞的生存和能量代謝,2,4,6-TCP含量根據(jù)實驗需要而變化.

試劑:2,4,6-TCP(分析純,98%),購自上海晶純試劑有限公司;甲醇(色譜純);其他試劑未經(jīng)特別說明,均為分析純.

1.2 實驗方法

菌體培養(yǎng):PSB-DR種子液以50%的接種量(體積比)接種至含有200mg/L 2,4,6-TCP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,將裝有200mL培養(yǎng)液的錐形瓶置于光照培養(yǎng)箱中(4800lx、30℃)培養(yǎng)5d至生長平穩(wěn)期后,再按 50%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5d左右,如此連續(xù)進(jìn)行3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng),以獲得大量的光合細(xì)菌菌體細(xì)胞.將轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后的菌懸液在12000r/min下離心10min,用無菌生理鹽水洗滌 2次后重新懸浮于一定體積的磷酸緩沖液中,調(diào)節(jié)OD510=3.0左右,作為降解實驗的原菌液待用.

靜息細(xì)胞對2,4,6-TCP的降解:取60mL原菌液接種至含有140mL降解培養(yǎng)基的錐形燒瓶中.溶液中2,4,6-TCP濃度為50mg/L,在光照培養(yǎng)箱中(光照度 4800lx、30℃)培養(yǎng) 7d,每隔 1d取樣測定溶液中 2,4,6-TCP的殘余量并測定菌懸液濃度.

靜息和生長細(xì)胞對 2,4,6-TCP的降解:取一定量原菌液分別接種于含50mg/L 2,4,6-TCP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(基礎(chǔ)培養(yǎng)基中醋酸鈉濃度分別為0,0.4,0.8,1.2,1.6g/L),光照培養(yǎng)7d后取樣測定2,4, 6-TCP的濃度,每組實驗設(shè)2個平行,重復(fù)2次.

2,4,6-TCP降解性能影響因素實驗:取一定體積的原菌液接種于含50mg/L 2,4,6-TCP的降解培養(yǎng)基中,分別考察光照、接種量、初始pH值對 2,4,6-TCP降解率的影響.條件:光照培養(yǎng)(250mL錐形瓶裝一定量培養(yǎng)物,敞口靜置;光照度為4800lx,溫度為30℃),接種量為30%,pH值7.0.實驗中,改變 1個影響因素,固定其他條件,從而確定最優(yōu)降解條件.培養(yǎng)7d后取2mL菌懸液,樣品在12000r/min下離心10min,上清液經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾后用高效液相色譜通過外標(biāo)法定量測定2,4,6-TCP濃度,每組實驗設(shè)2個平行,重復(fù)2次.

降解過程的動力學(xué)參數(shù):將原菌液以 30%的接種量分別接種至2,4,6-TCP濃度為10,20,50,80, 100,140mg/L的降解培養(yǎng)基中進(jìn)行反應(yīng),測定底物濃度對反應(yīng)速率的影響.

1.3 分析方法

菌懸液濃度:菌懸液濃度用UV-759S紫外-可見分光光度計測定,檢測波長為510nm,并以光密度值(OD510)表示.

活細(xì)胞吸收光譜的測定:菌懸液以轉(zhuǎn)速12000r/min離心 10min,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 60%蔗糖水溶液洗滌處理3次,將離心后的菌體細(xì)胞懸浮于蔗糖水溶液中,用紫外-可見分光光度計在波長200～900nm掃描.

2,4,6-TCP濃度的測定采用高效液相色譜儀(Jasco LC2000).分離柱為 ODS-C18反相色譜柱(250mm×4.6mm, 5μm);流速為 1mL/min;紫外檢測波長為 210nm;流動相為甲醇/水=90:10;柱溫為室溫;進(jìn)樣體積為20μL.

2,4,6-TCP降解率的計算:降解率E(%)=[(模擬廢水中初始2,4,6-TCP質(zhì)量濃度-培養(yǎng)7d后模擬廢水中2,4,6-TCP質(zhì)量濃度)/模擬廢水中初始2,4,6-TCP質(zhì)量濃度]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 PSB-DR的顯微特征

圖1為轉(zhuǎn)培后混合光合細(xì)菌PSB-DR掃描電鏡圖.從細(xì)胞外形上看,PSB-DR主要為短桿形、卵形和球形混雜,大小差異顯著.革蘭氏染色表明,PSB-DR為革蘭氏陰性菌,菌體活細(xì)胞吸收光譜測定結(jié)果顯示,最大吸收峰在375、525、590、803、850nm處,表明存在菌葉綠素和類胡蘿卜素,菌體活細(xì)胞吸收光譜具有光合細(xì)菌的典型吸收特征.目前,關(guān)于光合細(xì)菌降解環(huán)境污染物的研究大多是以純菌種為對象[11-16],但由于純菌種在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基需要滅菌,易受雜菌污染,因此較難在實際廢水處理工程中應(yīng)用.此外,有研究表明,與純菌種相比,混合菌對氯酚類化合物的降解效率更高[17].因此,后續(xù)實驗均采用該混合光合細(xì)菌PSB-DR.

圖1 PSB-DR電鏡掃描照片(×10000)Fig.1 Scanning electron micrograph of PSB-DR(×10000)

2.2 PSB-DR靜息細(xì)胞對2,4,6-TCP的降解

圖2 PSB-DR的生長曲線和2,4,6-TCP降解曲線Fig.2 Growth curve of PSB-DR and biodegradation curve of 2,4,6-TCP

由圖2可見,實驗過程中OD510基本無明顯變化,表明在整個降解過程中,細(xì)胞濃度沒有增加,也說明本實驗選擇的 2,4,6-TCP降解培養(yǎng)基體系不適于細(xì)胞大量增殖,細(xì)胞基本處于靜息狀態(tài),但7d后PSB-DR對2,4,6-TCP的降解率達(dá)到85%以上,同時,滅活細(xì)胞實驗中 2,4,6-TCP濃度變化較小,說明實驗中 2,4,6-TCP的減少并不是由細(xì)胞的吸附作用引起的,這表明PSB-DR降解2,4,6-TCP是通過現(xiàn)有細(xì)胞里的酶起作用,PSBDR靜息細(xì)胞中可能存在高活性降解酶(系).此外,從圖2中可知,未接種的空白組2,4,6-TCP損耗僅為9%,對分析2,4,6-TCP降解效果的干擾并不大,故在后續(xù)實驗中忽略其損耗.

2.3 靜息和生長細(xì)胞對2,4,6-TCP降解率的影響

為考察靜息和生長細(xì)胞對 2,4,6-TCP的降解效果,以期尋求 2,4,6-TCP降解的較優(yōu)工藝條件.在實驗中設(shè)置了一系列醋酸鈉濃度不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(醋酸鈉是光合細(xì)菌能較好利用的典型碳源,具有顯著的促生長作用),將原菌液接種至這一系列培養(yǎng)基中,除醋酸鈉濃度外,其余條件均一致,光照培養(yǎng) 7d取樣測定 2,4,6-TCP的濃度,比較靜息細(xì)胞和生長細(xì)胞對 2,4,6-TCP的降解效果,實驗結(jié)果見圖3.

圖3 醋酸鈉濃度對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.3 Effect of sodium acetate concentration on 2,4,6-TCP degradation

結(jié)果顯示,2,4,6-TCP的降解率受培養(yǎng)基中醋酸鈉濃度的影響,在不加入醋酸鈉時,整個降解過程細(xì)胞濃度基本維持不變,細(xì)胞處于靜息狀態(tài),但對2,4,6-TCP的降解率卻最高(86.8%);在醋酸鈉濃度為0.4～1.6g/L時,細(xì)胞處于生長狀態(tài)(菌懸液濃度 OD510快速上升,數(shù)值未在圖中列出), 2,4,6-TCP的降解率卻隨醋酸鈉濃度的升高而降低且明顯低于靜息細(xì)胞的降解率.分析原因,可能是醋酸鈉的加入對底物的酶促反應(yīng)產(chǎn)生了非競爭性抑制作用,降低了酶的活性,導(dǎo)致降解率的下降.實驗結(jié)果表明,對于PSB-DR采用靜息細(xì)胞法降解2,4,6-TCP是較佳的選擇.

2.4 光照對2,4,6-TCP降解率的影響

將PSB-DR原菌液接種至2,4,6-TCP濃度為50mg/L的降解培養(yǎng)基中,分別在黑暗、光照(敞口靜置)條件下培養(yǎng)7d并取樣測定2,4,6-TCP的濃度,實驗結(jié)果見圖4.

圖4 光照對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.4 Effect of illumination on 2,4,6-TCP degradation

由圖4可知,PSB-DR在黑暗、光照條件下對2,4,6-TCP的降解能力存在明顯差異,7d后對2,4,6-TCP的降解率分別為6.2%、88.4%,即在黑暗條件下 2,4,6-TCP基本沒有被降解,光照成為2,4,6-TCP降解的關(guān)鍵限制因子.Blasco等[18]研究發(fā)現(xiàn)Rhodobacter capsulatus ElF1對2,4-DNP的降解是嚴(yán)格光依賴的,光照是其降解的限制因子.Thies等[19]發(fā)現(xiàn)小球藻對 metfurazon(一種除草劑)的N-位脫甲基作用由細(xì)胞色素P450羥化酶介導(dǎo),而P450羥化酶催化底物需要分子氧以及還原輔酶 Ⅱ(NADPH)的參與,在黑暗條件下, NADPH 產(chǎn)生量嚴(yán)重不足,因此小球藻對metfurazon的脫甲基活性依賴于光照條件.Liu等[20]在研究Alcaligenes eutrophus JMP134細(xì)胞中由質(zhì)粒pJP4編碼的羥化酶對二氯苯酚的羥基化作用時,也發(fā)現(xiàn)需要分子氧和NADPH的參與.本實驗中 2,4,6-TCP的降解需要在光照條件下進(jìn)行,推測PSB-DR對2,4,6-TCP的降解機(jī)制可能是一種酶促反應(yīng),該催化反應(yīng)的進(jìn)行需要由光合作用產(chǎn)生的NADPH參與,這與2.2中的結(jié)果(降解是通過現(xiàn)有細(xì)胞里的酶起作用)相符.綜上,后續(xù)實驗均選擇在光照條件下進(jìn)行.

2.5 接種量對2,4,6-TCP降解率的影響

將PSB-DR原菌液接種至2,4,6-TCP濃度為50mg/L的降解培養(yǎng)基中,接種量分別為 10%、20%、30%、40%和50%,光照培養(yǎng)7d后取樣測定2,4,6-TCP的降解率,實驗結(jié)果見圖5.

圖5 接種量對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.5 Effect of inoculum density on 2,4,6-TCP degradation

結(jié)果表明,在相同的培養(yǎng)條件下,PSB-DR的接種量不同,2,4,6-TCP的降解也呈現(xiàn)出不同的結(jié)果.接種量為 10%時,由于菌體濃度較低(降解酶濃度較低),2,4,6-TCP的降解率只有32.9%;當(dāng)接種量小于 30%時,2,4,6-TCP的降解率與接種量成正相關(guān)關(guān)系,繼續(xù)增加接種量,降解率反而略有下降(猜測傳質(zhì)阻力和代謝環(huán)境惡化成為限制因素).可見30%的接種量為該條件下的最適投菌量,故后續(xù)實驗中PSB-DR的接種量均定為30%.

2.6 初始pH值對2,4,6-TCP降解率的影響

將PSB-DR原菌液以30%的接種量接種至2,4,6-TCP濃度為50mg/L的降解培養(yǎng)基中,用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)初始pH值,使其分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,光照培養(yǎng) 7d后取樣測定2,4,6-TCP的降解率,實驗結(jié)果見圖6.

圖6 初始pH值對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.6 Effect of initial pH value on 2,4,6-TCP degradation

結(jié)果表明,體系在pH值為6.0～10.0之間時, PSB-DR對2,4,6-TCP的降解率均大于50%,說明PSB-DR有較強(qiáng)的pH適應(yīng)性,PSB-DR靜息細(xì)胞對2,4,6-TCP的降解率隨初始pH的遞增先增大后減小,其中以pH值為7.0時為最佳,過高或過低的pH值對2,4,6-TCP的降解都有不同程度的抑制作用.故在本實驗條件下,選擇 2,4,6-TCP的較優(yōu)降解條件為pH值為7.0的中性條件.胡筱敏等[21]在研究光合細(xì)菌PSB-1D對2-氯苯酚的降解特性時發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為7.0時,菌株P(guān)SB-1D對2-CP的降解率最大,7d后對50mg/L的2-CP降解率達(dá) 60.99%;王玉芬等[22]在研究光合細(xì)菌球形紅細(xì)菌厭氧降解氯代苯時也得到類似的結(jié)論.雖然本實驗中所用為完整細(xì)胞,細(xì)胞本身會對外界氫離子濃度的改變有一定的緩沖作用,但反應(yīng)體系pH值的變化仍可能對細(xì)胞內(nèi)酶的電離情況和酶蛋白的空間構(gòu)象有所影響[23],從而改變酶的催化活性.

2.7 2,4,6-TCP最佳降解時間的確定

圖7為生化反應(yīng)時間對2,4,6-TCP降解率的影響(最佳降解條件下).從圖7可以看出,反應(yīng)1d后2,4,6-TCP的降解率為55.5%,隨著反應(yīng)時間的增加,5d后的降解率達(dá)到了82.3%,雖然7d后的降解率(88.5%)高于 5d后的降解率,但在實際工程應(yīng)用中考慮到經(jīng)濟(jì)性方面的原因,故選擇時間相對更短的5d作為2,4,6-TCP降解的最佳反應(yīng)時間.本實驗中2,4,6-TCP降解需要光照,但光照是實際工程中需要考慮的不利因素之一,PSBDR靜息細(xì)胞降解2,4,6-TCP的成功為工程上固定化細(xì)胞大規(guī)模降解 2,4,6-TCP提供了良好的應(yīng)用前景.

圖7 反應(yīng)時間對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.7 Effect of retention time on 2,4,6-TCP degradation

2.8 2,4,6-TCP降解動力學(xué)分析

圖8 不同初始濃度下2,4,6-TCP的降解情況Fig.8 Degradation of 2,4,6-TCP under different initial concentrations

通過降解動力學(xué)模型的建立可以預(yù)測微生物降解污染物的趨勢并對生化反應(yīng)的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,為工程應(yīng)用提供指導(dǎo).本實驗設(shè)置了不同初始濃度的 2,4,6-TCP在最佳降解條件下進(jìn)行底物濃度的酶動力學(xué)反應(yīng).

由圖8可見,2,4,6-TCP的降解率隨著其初始濃度的升高而降低,當(dāng) 2,4,6-TCP初始濃度為10mg/L時,7d后2,4,6-TCP能夠被完全降解,隨著其濃度升高到 100mg/L,7d后降解率下降為70.2%,當(dāng)2,4,6-TCP濃度為140mg/L時,7d后降解率已經(jīng)下降到 63%,可見隨著濃度的升高2,4,6-TCP對菌體的毒性逐漸增強(qiáng).圖9顯示了在不同初始濃度下 2,4,6-TCP降解的初始反應(yīng)速率(最初24h內(nèi)).

圖9 不同初始濃度下2,4,6-TCP的初始反應(yīng)速率Fig.9 Variation of the initial rate of 2,4,6-TCP degradation with initial 2,4,6-TCP concentration

從圖9中可以看出,初始濃度小于100mg/L時,初始降解速率隨著 2,4,6-TCP濃度的升高而升高,而后達(dá)到某一極大值后會有所下降,表明2,4,6-TCP的降解(基于初始反應(yīng)速率)符合高濃度底物抑制的酶促反應(yīng)類型,故采用Andrews方程模擬其降解動力學(xué)過程.

式中: ri為存在抑制劑時的酶促反應(yīng)速率, h-1; c為底物濃度, mg/L; Km為米氏常數(shù), mg/L; Ki為抑制常數(shù), mg/L; rmax為不存在抑制劑時的最大酶促反應(yīng)速率常數(shù),h-1.

當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(小于100mg/L),以1/ri對1/c作圖(圖10),從直線的斜率和截距求得動力學(xué)參數(shù) rmax=1.746h-1,Km=38.333mg/L.當(dāng)初始反應(yīng)速率達(dá)到最大,即當(dāng) c=100mg/L時, Ki=c2/Km= 260.87mg/L,因而得到 PSB-DR降解 2,4,6-TCP的動力學(xué)方程為:

圖10 低2,4,6-TCP濃度下1/c和1/ri之間的關(guān)系Fig.10 Relationship between 1/c and 1/ri during low initial 2,4,6-TCP concentrations

3 結(jié)論

3.1 本實驗中,靜息細(xì)胞法對2,4,6-TCP的降解作用優(yōu)于生長細(xì)胞法,培養(yǎng)液中添加醋酸鈉會對2,4,6-TCP的降解產(chǎn)生抑制作用.PSB-DR靜息細(xì)胞對 2,4,6-TCP的最佳降解條件為:光照培養(yǎng)(30℃、4800lx),接種量30%,初始pH值為7.0.在最佳條件下,50mg/L的2,4,6-TCP經(jīng)5d降解率達(dá)82.3%.

3.2 在2,4,6-TCP初始濃度為10～140mg/L時,靜息細(xì)胞對 2,4,6-TCP的降解符合高濃度底物抑制的酶促反應(yīng)類型,最大酶促反應(yīng)速率常數(shù)rmax=1.746h-1,米氏常數(shù) Km=38.333mg/L,抑制常數(shù) Ki=260.87mg/L.米氏常數(shù)能夠反映酶與底物之間親和力的大小,本實驗中 Km值較小,說明細(xì)胞對底物的催化效果較好.

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Biodegradation characteristics of 2,4,6-trichlorophenol by photosynthetic bacteria.

YAO Bin, JIN Zan-fang, HU Zhong-ce, JIN Qiong, PAN Zhi-yan*(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China). China Environmental Science, 2011,31(10)：1669～1675

Degradation of 2,4,6-trichlorophenol (2,4,6-TCP) by mixed cultures photosynthetic bacteria PSB-DR at different illumination, inoculum density and initial pH were investigated. The degradation conditions were optimized to be incubation with an inoculum density of 30% and initial pH 7.0 under light. About 82.3% of 2,4,6-TCP with initial concentration of 50mg/L was removed after 5d incubation under the condition. The addition of sodium acetate into the substrate greatly suppressed 2,4,6-TCP biodegradation. The degradation of 2,4,6-TCP could be well described by the enzymatic reaction of high concentration inhibition, with the maximum substrate utilization rate 1.746h-1, Michaelis-Menten constant 38.333mg/L and inhibitory constant 260.87mg/L, respectively.

photosynthetic bacteria；biodegradation；2,4,6-trichlorophenol；biodegradation kinetics

X172

A

1000-6923(2011)10-1669-07

2011-01-07

國家科技重大專項(2008ZX07101-006);國家自然科學(xué)基金資助項目(40803027);浙江省環(huán)境污染控制技術(shù)研究重點實驗室項目(2010-09)

* 責(zé)任作者, 教授, panzhiyan@zjut.edu.cn

姚 斌(1985-),男,浙江蕭山人,浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院碩士研究生,主要從事工業(yè)廢水微生物處理法方面的研究.發(fā)表論文1篇.