在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中神經(jīng)干細胞移植對突觸素表達的影響

馬海英 喻 博 關 水 馬學虎 石玉秀

在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中神經(jīng)干細胞移植對突觸素表達的影響

馬海英1，3喻 博2關 水4馬學虎4石玉秀1＊

（1中國醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室，病理學與病理生理學研究所，沈陽110001；2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110004；3大連醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室，遼寧116044；4大連理工大學干細胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧116024）

目的 探討神經(jīng)干細胞（NSCs）移植對創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）模型大鼠感覺運動功能的恢復作用及其對損傷腦組織中突觸素（SYP）表達的影響。方法 體外培養(yǎng)大鼠胚胎皮質(zhì)NSCs；采用Feeney法制備TBI模型，于造模后72 h，移植組采用PKH26熒光示蹤劑標記的NSCs直接移植于腦損傷區(qū)，對照組以等量生理鹽水代替NSCs；分別于移植后不同時間點，采用Grid walk和Latency試驗檢測TBI大鼠的感覺運動功能；熒光顯微鏡下計數(shù)移植細胞的存活數(shù)量；采用免疫印跡和RTPCR技術檢測腦損傷區(qū)及周圍組織中SYP的表達。結(jié)果 NSCs移植大鼠前、后肢功能分別在移植后第2 w和4 w恢復至手術前水平，而直到第8 w，對照組大鼠后肢功能和通過平板移動時間與NSCs移植組和基線比較仍有顯著性差異（P＜0.05）。移植的NSCs隨移植時間延長存活數(shù)量減少，移植后第4 w和8 w的存活數(shù)分別為6.3%±1.0% 和4.1%±0.9%。在移植后的8 w期間，移植組腦損傷區(qū)及周圍組織中SYP的表達均明顯高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論 移植的NSCs在TBI腦內(nèi)能夠存活，并明顯改善了TBI大鼠對側(cè)肢體的感覺運動功能；NSCs移植促進了腦損傷區(qū)及周圍組織中SYP的表達，這可能是NSCs移植促進功能恢復的機理之一。

神經(jīng)干細胞；移植；創(chuàng)傷性腦損傷；突觸素

創(chuàng)傷性腦損傷（Trau matic Brain Inj ury，TBI）是指由外傷引起的腦組織損傷。在美國，每年大約170萬人發(fā)生TBI，是損傷致死的主要原因之一，也是兒童和青少年致殘的主要原因之一［1］。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，對TBI的治療已經(jīng)取得了很大的進展。然而，臨床上治療TBI失敗的主要原因可能是由原發(fā)損傷引起的二次損傷［2］。嚴重的腦損傷產(chǎn)生不同程度的功能缺陷，甚至導致永久性殘疾或植物人。目前，對TBI缺乏有效的治療措施來恢復患者由損傷引起的各種功能缺陷。

神經(jīng)干細胞（Neural stem cells，NSCs）的特征和成功分離培養(yǎng)使直接移植這些細胞治療腦損傷成為可能。研究表明，在發(fā)育期胚胎和成年哺乳類動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著具有多向分化潛能的神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞在胚胎腦的端腦、小腦、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、腦室／腦室下區(qū)、室管膜／室管膜下區(qū)、脊髓等處分布廣泛［3］。在成年哺乳動物，神經(jīng)干細胞主要分布在側(cè)腦室的腦室下區(qū)（subvent ricular zone，SVZ）和海馬的顆粒下帶（subgranular zone，SGZ），具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的潛能，并能向損傷區(qū)定向移動，在不同的微環(huán)境中分化為不同細胞［4］。NSCs在促分化因子的作用下可以在體外定向分化發(fā)育成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的研究，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復出現(xiàn)了新的希望。國外實驗研究證明，通過NSCs移植替代治療可能實現(xiàn)修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的組織損傷并部分恢復由損傷引起的功能缺陷。其機制除細胞代替治療作用外，可能與神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放、細胞與細胞間信號傳導等有關［5，6］。NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷恢復受損功能的機制尚不完全清楚。

突觸素（Synaptophysin，SYP）是突觸前神經(jīng)末梢的標志蛋白，能夠與其它的蛋白相互作用，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，突觸小泡融合、突觸形成和能量代謝等廣泛作用。因為突觸的丟失與腦功能障礙的程度有 關［7-9］，SYP 的 水 平也 作 為腦 的 功 能 性 標志［10］。

本研究采用熒光示蹤劑PKH26標記NSCs，移植于TBI模型大鼠腦內(nèi)，觀察其存活及其對損傷腦組織中SYP表達的影響，探討了NSCs移植TBI恢復感覺運動功能可能的機制。

材料和方法

1.實驗材料

1.1 實驗動物

E14 Wister大鼠胚胎15只，150-200g Wister大鼠60只，雌雄各半，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

PKH26、DMEM／F12、B27、EGF和b FGF培養(yǎng)基（Sig ma公司）；抗鼠巢蛋白單克隆抗體，兔抗鼠βⅢ-微管蛋白多克隆抗體（SANTA CRUZ公司）。FBS（Invitrogen）；Accutase T M 酶（eBioscience）。

2.方法

2.1 NSCs的培養(yǎng)、體外分化

原代培養(yǎng)的NSCs由大連理工大學干細胞與組織工程研發(fā)中心提供。將原代培養(yǎng)的NSCs以2×105／ml的密度接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為6 ml DMEM／F12 培養(yǎng)基（含 B27、EGF、b FGF），37℃，5%CO2，每6-7d傳代1次，傳3-10代備用。采用多聚鳥氨酸處理無菌蓋玻片，置于24孔板中，用含10%FBS的培養(yǎng)基對傳代培養(yǎng)的NSCs進行體外誘導分化。

2.2 免疫細胞化學檢測

分別采用巢蛋白和βⅢ-微管蛋白進行免疫細胞化學染色鑒定NSCs和分化細胞中的神經(jīng)元表型。細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100孵育，非免疫血清孵育。分別滴加鼠抗巢蛋白單克隆抗體（1∶200）和兔抗鼠βⅢ-微管蛋白多克隆抗體（1∶200），4℃過夜，PBS漂洗3次，每次5 min。分別滴加 羊 抗 小 鼠 Texas-Red和 羊 抗 兔 FITC-Ig G（1∶1000），37℃避光孵育30 min。DAPI復染細胞核，封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.3 創(chuàng)傷性腦損傷模型制備

采用改良的Feeney法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型［11］。將60只成年 Wister大鼠，以10%水合氯醛按40 mg／kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉后固定于立體定向儀上，切開頭皮，分離皮下組織及骨膜。在前囟后3 mm，矢狀縫左3 mm處用顱鉆鉆取直徑約為3 mm的骨窗，保持硬腦膜的完整。采用改良的打擊裝置，以10g砝碼從30c m高處自由墜落，撞擊該處硬腦膜，造成顱腦挫裂傷。

2.4 PKH26示蹤劑標記NSCs

移植前收集NSCs，加入Accutase T M酶，制備成單細胞懸液。PKH26染色方法按說明書進行。染色體系中PKH26和NSCs的濃度分別為4×10-6 M和1×107／ml。用生理鹽水重懸NSCs，終濃度為1×108／ml，置于冰上備用。

2.5 動物分組與NSCs移植

造模后72h，將動物再次麻醉，固定于立體定位儀上，暴露創(chuàng)傷灶，實驗組36只，對照組24只，實驗組在創(chuàng)傷灶中心，用微量注射泵將3μL PKH26標記的NSCs懸液注入硬腦膜下1.1 mm處，注射10分鐘，停留5分鐘后拔出注射器。對照組注射等量生理鹽水。以后動物常規(guī)飼養(yǎng)。每組動物分別于移植后1d、4d、7d，2 w、4w、8w 取材，用于移植細胞計數(shù)、免疫印跡和RT-PCR檢測。

2.6 神經(jīng)行為學檢查

Grid wal k試驗和latency試驗［12］廣泛的應用于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的感覺運動功能檢測。Grid wal k試驗裝置為64c m×40c m×50c m（長×寬×高）方格網(wǎng)，網(wǎng)孔面積為25 mm×25 mm。方格網(wǎng)的下方放置錄像機，用以記錄試驗動物5分鐘內(nèi)失足次數(shù)和總移步次數(shù)。% 失步＝ （失步次數(shù)／總移步次數(shù)）×100，不對稱分值＝ （% 對側(cè)失步-%同側(cè)失步）.失足規(guī)定為癱側(cè)任一肢體不能抓緊格線而導致足落于網(wǎng)格以下或踏空者。

Latency試驗裝置是30c m×10 c m（長×寬）的平板放置在100 c m高處，將動物放與平板的一次，記錄動物通過平板時間，每次檢測每只動物試驗3次，取平均值。造模前，所有動物接受訓練3d，以獲得穩(wěn)定的基線水平，并分別于移植后1d和移植后1 w、2 w、4 w和8 w檢查。

2.7 細胞存活計數(shù)

分別于不同時間點，動物麻醉后，4%多聚甲醛灌流固定，取全腦，后固定過夜，行全腦冰凍切片。于熒光顯微鏡下觀察NSCs的存活數(shù)。200倍鏡下，每10張切片計數(shù)1張PKH26標記的NSCs（自前囟前1 mm至前囟后4 mm），每只動物計數(shù)細胞數(shù)×10作為該動物存活細胞數(shù)。

2.8 免疫印跡分析

取腦損傷區(qū)及周圍組織，提取總蛋白。于12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移法（轉(zhuǎn)膜條件：100 V 3h）將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，在含5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1h，加入抗鼠SYP單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，TBS充分漂洗（10 min×3次），加入HRP標記的羊抗鼠Ig G（1∶2000），室溫作用1 h，TBS充分漂洗（10 min×3次），ECL顯影，暗室曝光成像。Smartview凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。

2.9 RT-PCR 分析

采用異硫氰酸胍-酚-氯仿（TRIzol）兩步法提取腦損傷區(qū)及周圍組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。PCR反應條件：94℃3分鐘預變性；98℃10秒，50℃15秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)；72℃ 延伸10分鐘。PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，SYP上游引物：5’-CGATGCGGGCTATGGGCAGG-3’，下游引物：5’-AGTCGCCCTGAGGCCCGTAG-3’，內(nèi)參照 GAPDH 上游引物：5’-TGTGATGGGTGTGAACCACGAGA-3’；下游引物：5’-GAGCCCTTCCACAATGCCAAAGTT-3’。取2μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下成像，用Image Master ED軟件計算各電泳條帶的強度值，以目的基因條帶和內(nèi)參照基因條帶的強度之比（SYP／GAPDH）為目的基因mRNA表達的相對值，據(jù)此相對值，即可判斷各樣品中SYP mRNA表達程度的差異。

3.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.NSCs培養(yǎng)與鑒定在培養(yǎng)基中，NSCs呈球團狀懸浮生長，巢蛋白表達陽性（圖1 A，B）。用含10%FBS的培養(yǎng)基對NSCs進行體外誘導分化，發(fā)現(xiàn)分化后第2天，多數(shù)細胞伸出突起，以后突起逐漸延長，分支增加。分化后第5天，βⅢ-微管蛋白陽性細胞為13.9±6.3%（圖1C，1D）。

圖1 NSCs的培養(yǎng)、分化與鑒定結(jié)果A：第10代NSCs球；B：NSCs球巢蛋白染色陽性；C：誘導分化后第5d，NSCs發(fā)生分化；D：βⅢ-微管蛋白免疫反應陽性細胞（DAPI復染細胞核）。Fig.1 Culture，differentiation and identification of NSCs A：NSCs neurosphere；B：NSCs neurospheres were Nestin positive；C：NSCs were differentiated f or 5 days；D：βⅢ-t ubulin positive cells for neurons in differentiated NSCs（nuclei were identified by a blue DAPI counterstain）.

2.神經(jīng)行為學檢測

所有動物TBI損傷后均表現(xiàn)出明顯的運動功能障礙。NSCs移植組和對照組前后肢功能均隨時間延長而出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。在Grid wal k試驗中，NSCs移植組前后肢功能分別在移植后第2w和4w恢復至手術前水平。而對照組前、后肢表現(xiàn)出更明顯的對側(cè)肢體障礙，前肢功能直到第8 w恢復至基線水平。T-檢驗結(jié)果表明，至少4 w內(nèi)對照組前肢不對稱分值明顯高于移植組（P＜0.05）。盡管在第1w后肢功能在兩組之間沒有顯著性差異，但在第8 w，對照組后肢功能與移植組和基線水平比較，均有明顯差異（圖2 A，2B）。在Latency試驗中，在8 w內(nèi)對照組通過平板的移動時間均明顯長于NSCs移植組（P＜0.05），而移植組的移動時間于第2 w恢復至手術前水平 （圖2C）。

圖2 神經(jīng)行為學檢測A：前肢不對稱分值；B：后肢不對稱分值；C：Latency試驗。Fig.2 Behavioral f unctional tests A：foreli mb asy mmetry differences；B：hindli mb asy mmetry differences；C：Latency to move

3.NSCs移植后在腦內(nèi)的存活

CCI損傷造成實驗大鼠左側(cè)皮質(zhì)及同側(cè)海馬發(fā)生明顯的細胞丟失。在熒光顯微鏡下觀察，對照組未見紅色熒光細胞，在NSCs移植組，PKH26標記的NSCs被激發(fā)出紅光。對PK H26標記的NSCs進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，實驗期間存活細胞逐漸減少（圖3 A-G）。移植后第4d，細胞存活數(shù)為第1d的41%。在移植后第4 w和第8 w，細胞存活數(shù)量分別為移植細胞數(shù)的6.3%±1.0% 和4.1%±0.9%。

圖3 移植后不同時間點，移植NSCs的存活數(shù) 可見移植細胞存活數(shù)隨移植時間延長而減少。自移植后第2 w，移植細胞從胞體伸出明顯的突起。Fig.3 Survival of cortical NSCs at different ti me points post-transplantation There was a significantly reduction in the nu mber of survival cells during experi mental period.Many engrafted cells extended pr ocesses since 2 weeks post-transplantation.

4.NSCs移植對損傷腦組織中突觸素表達的影響

RT-PCR和免疫印跡檢測結(jié)果顯示，在移植后的不同時間點，SYP在基因和蛋白水平表達均明顯高于對照組 （P＜0.05）。與對照組比較，在NSCs移植后的第1周，SYP mRNA表達明顯增強（P＜0.01），且在移植后的第4周達到最高水平（圖4 A，4B）。SYP的蛋白表達與基因表達結(jié)果相一致（圖4C，4D）。

圖4 移植后不同時間點，損傷腦組織中SYP的表達A和C分別為RT-PCR電泳圖和免疫印跡結(jié)果，其中條帶1，3，5和7為移植組，2，4，6和8為對照組；1和2，3和4，5和6，7和8分別為移植后1，2，4和8w；B和D分別為SYP／GAPDH 和SYP／Actin的相對值分析。Fig.4 Expression of SYP in transplant site and the boundary zone of the lesion A and C：RT-PCR and Western blot analysis of SYP；C and D：＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs saline control group at different ti me points.In（A）and（C），Lane 1，3，5 and 7 from NSCs transplant rats，and lane 2，4，6 and 8 from saline control rats.Lane 1 and 2，3 and 4，5 and 6，7 and 8 derived fro m rats at 1，2，4 and 8 weeks post-transplantation，respectively.

討 論

NSCs被認為是神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)前體細胞，具有很強的增殖能力和自我更新能力，能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起重要作用。NSCs的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復提供了巨大的治療前景。本實驗采用目前常用的體外培養(yǎng)NSCs的方法進行NSCs培養(yǎng)。并用巢蛋白和βⅢ-微管蛋白對培養(yǎng)的NSCs和其分化為神經(jīng)元的表型進行了鑒定。

以前的研究表明NSCs移植急性期TBI可能有助于腦損傷的恢復。在損傷后第3天，通過立體定位進行NSCs腦內(nèi)移植，移植細胞在創(chuàng)傷性腦損傷腦內(nèi)可以存活，并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，減輕腦損傷引起的運動功能損傷［13］。在我們的研究中，TBI損傷引起了明顯的運動功能障礙。在損傷后第3天，于損傷灶直接移植NSCs懸液，在選擇性的感覺運動功能試驗中，NSCs移植鼠前后肢功能分別在移植后第2周和4周恢復至手術前水平，而直到第8周，對照組大鼠后肢功能和通過平板移動時間與NSCs移植鼠和基線比較仍有顯著性差異。這些結(jié)果表明，于TBI損傷后第3天，NSCs移植能夠明顯改善對側(cè)肢體的運動功能，促進TBI損傷引起的運動功能缺陷的恢復。

我們的結(jié)果顯示，在實驗期間內(nèi)，隨著移植時間延長，存活細胞數(shù)明顯減少。特別是在移植的早期，移植后第4天細胞存活數(shù)是移植后第1天細胞存活數(shù)的41%。在移植后第8周，移植細胞的存活數(shù)是移植細胞數(shù)的4.1%。在移植早期，移植細胞存活數(shù)明顯減少可能與急性損傷引起的微環(huán)境改變有關，包括由原發(fā)損傷引起的繼發(fā)損傷、血腦屏障的破壞和一系列復雜的炎性反應介導了細胞死亡，并且負面的影響了移植細胞的存活和遷移［14，15］。研究表明 在TBI損傷后的3-48 h內(nèi)，炎性反應可能誘導凋亡相關基因的上調(diào)［16］。本研究證明，盡管在TBI急性期NSCs移植治療中，移植細胞能夠存活，并且促進了運動功能改善，但是TBI急性期的微環(huán)境不利于移植細胞的存活，導致了移植早期大量細胞死亡。因此，我們建議TBI損傷的最佳NSCs移植時間可能是亞急性期，因為TBI引起的炎性反應和細胞因子的釋放主要發(fā)生在亞急性期之前（1-7 d），而巨噬細胞的聚集和膠質(zhì)瘢痕的形成發(fā)生在1 w以后［17，18］。然而，Harting等人報道［6］，于 TBI損傷后7 d，NSCs直接注入損傷灶，在移植后的48 h和2 w，細胞存活數(shù)為1.4-1.9%，低于本研究中的細胞存活數(shù)。可能的解釋是盡管目前還沒有研究證明最佳的移植條件，但移植細胞的存活和移植的具體過程有關，包括移植量、注射速度、針頭移出等方式有關。

在NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，移植細胞與宿主細胞建立突觸聯(lián)系、建立細胞外信號連接并與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡整合的能力是細胞移植恢復受損功能的必要條件。各種損傷后的突觸和軸突再建對預測損傷后的神經(jīng)修復具有重要意義。SYP是一種突觸前囊泡上的膜蛋白，與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關。SYP幾乎存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)末梢，參與突觸囊泡的導入、轉(zhuǎn)運和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸囊泡再循環(huán)和突觸發(fā)生［19］。TBI損傷引起的氧化過程可能導致了突觸蛋白的丟失，因此影響神經(jīng)細胞的存活和功能［20］。本研究中，NSCs移植TBI明顯促進了損傷腦組織中SYP的基因和蛋白表達，這可能與NSCs移植促進TBI大鼠感覺運動功能的恢復有關，其機制有待于進一步研究。

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Effect of neural stem cells transplant on expression of synaptophysin in a rat model of traumatic brain injury

Ma Haiying1，3，Yu Bo2，Guan Shui4，Ma Xuehu4，Shi Yuxiu1＊
（1Depart ment of histology and embr yology，Institute of pathology and pathophysiology，China medical university，Shenyang 110001，China；2Depart ment of neurosur ger y，Shengjing hospital af f iliated of China medical university，Shenyang 110004，China；3Depart ment of histology and embr yol ogy，Dalian medical university，Dalian 116044，China；4Dalian R＆D Center f or Stem Cell and Tissue Engineering，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China）

Objective To evaluate the effect of neural stem cells（NSCs）transplant on sensori motor f unction and synaptophysin（SYP）in injured-brain of a rat model of trau matic brain injur y（TBI）.Met hods Cortical NSCs derived from E14 rat embroes were cultured.A rat model of TBI was conducted according to previous report by Feeney.At 72 hours after TBI injur y，t he transplant gr oup

delivery of t he NSCs labeled by PKH26，while Grid wal kand Latency to move t he contr ol gr oup received equivalent saline sol ution tests were used to eval uated t he sensori motor f unction of t he ani mals.The nu mber of sur viving cells was quantified under fluorescent microscope.Western blot and RT-PCR were conducted to assess the expression of SYP in injured brain.Results NSCs transplant rats to returned to pre-surgery levels at 2 and 4 weeks in f oreli mb and hindli mb perf or mance，respectively.However，Hindli mb perf or mance and latency to move in saline contr ol rats revealed significant diff erence co mpared to baseline and NSCs transplant rats at 8 weeks.Engrafted NSCs demonstrated a decrease in t he nu mber of survival cells during the 8-week period.The percentage of surviving cell is 6.3%±1.0%and 4.1%±0.9%of engrafted cells at 4 and 8 weeks post-transplantation，respectively.mRNA and protein expression of SYP were significantlyhigher in NSCs transplant rats compared to those in saline control rats during 8-week period post-transplantation（P＜0.05）.Concl usion NSCs transplanted directl y into t he injured brain are capable of sur viving in a rat model of TBI.Engrafted NSCs increase expression of SYP in inj ured brain of TBI rats，which is suggested as one of t he mechanis ms underlying t he i mproved f unctional recovery on sensori motor behavior due to NSCs transplant f ollowing TBI.

Neural stem cells；Transplant；Trau matic brain inj ury；Synaptophysin

R329

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.019

2011-08-10

2011-10-01

遼寧省教育廳科學技術研究項目 （2008851，2008779）

馬海英，女（1975年），漢族，博士研究生。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）