乳腺癌干細(xì)胞的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

劉祥偉，曲延玉（綜述），陳德滇，楊莊青（審校）

（1.昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院乳腺科，昆明 650118;2.楚雄醫(yī)專(zhuān)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，云南楚雄 675005）

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在腫瘤的治療中，從腫瘤的起源上來(lái)尋求病因?qū)W治療一直是人們研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)許多類(lèi)型的腫瘤（包括乳腺癌）都是由類(lèi)似干細(xì)胞的細(xì)胞分化而來(lái)。因此，人們?cè)诟杉?xì)胞的理論基礎(chǔ)上提出了腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)。在乳腺癌的治療中，一直沒(méi)有關(guān)于乳腺癌的病因?qū)W治療的明確報(bào)道。自從2003年人們首次從乳腺癌組織中分離出乳腺癌干細(xì)胞［1］至今。這些細(xì)胞在腫瘤的轉(zhuǎn)移和治療后的復(fù)發(fā)中所起的作用備受關(guān)注。

1 乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與分離方法

1.1 乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 2003年，Al-Hajj等［1］在有乳腺癌生長(zhǎng)的免疫低下小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，只有少數(shù)的細(xì)胞能夠發(fā)生腫瘤。盡管成千上百萬(wàn)的細(xì)胞中僅有100個(gè)能夠發(fā)生腫瘤，但是這些細(xì)胞在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的每個(gè)階段都能夠發(fā)生作用。并且從這些細(xì)胞中分離CD44+CD24

－/lowLin－細(xì)胞群。這些細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，在不同階段發(fā)生作用，所以能為臨床治療提供很好的依據(jù)。此外，Kondo等［2］又從 MCF-7細(xì)胞系中分離出側(cè)亞群（side population，SP）細(xì)胞。Hemmati等［3］和 Singh 等［4］分別從人的腦腫瘤組織中以球形培養(yǎng)的方法分離出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，并表達(dá)CD133表面標(biāo)志。

1.2 乳腺癌干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) SP可能是一種普遍的干細(xì)胞表型，之所以在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)是由于細(xì)胞膜上的乳腺癌耐藥蛋白可泵出細(xì)胞內(nèi)Hoechst33342染料使其呈現(xiàn)淡染。Alvi等［5］從人和小鼠的正常乳腺上皮細(xì)胞中也分離出SP細(xì)胞，比率為0.20%～0.45%，在體內(nèi)外可進(jìn)一步分化為乳腺組織。根據(jù)這種方法，Kondo 等［2］嘗試從多種腫瘤細(xì)胞系中分離SP細(xì)胞，包括 C6、B104、Hela和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，其中SP細(xì)胞在MCF7中的比率約為2%。

Al-Hajj等［1］用8周齡的雌性NOD/SCID小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用氯胺酮/賽拉嗪對(duì)小鼠進(jìn)行全麻，用VP-16腹膜注射，使小鼠荷瘤。培養(yǎng)后分離出具有干細(xì)胞活性的CD44+CD24

－/lowLin－細(xì)胞群體。這類(lèi)干細(xì)胞經(jīng)小鼠體內(nèi)傳代，其自我更新和成瘤能力不變，每代均可重新形成包含干細(xì)胞和非干細(xì)胞表型的異質(zhì)性細(xì)胞群體。在A1-Hajj等的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞比例最小的腫瘤細(xì)胞移植于小鼠體內(nèi)后生長(zhǎng)也最為緩慢。在兒童神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，髓母細(xì)胞瘤比星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性度高，前者干細(xì)胞比率占1%，后者占25%。由此推斷，腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量可能與腫瘤的惡性程度相關(guān)。上皮細(xì)胞間質(zhì)中各成分的相互作用對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起決定作用［6］。CD44編碼人染色體11p13，有 2 種表型，標(biāo)準(zhǔn)型 CD44s和變異型 CD44v［7，8］。CD44的作用與CD24有關(guān)。然而，人乳腺癌具有異質(zhì)性，并且只有1/3具有CD44+CD24

－/lowLin－表型，并具有干細(xì)胞的特性。這類(lèi)腫瘤細(xì)胞在基底樣腫瘤和BRCA1 遺傳性乳腺癌中較多［9，10］。

2 乳腺癌干細(xì)胞的特點(diǎn)

研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞有許多相似點(diǎn)。許多學(xué)者都認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是由正常干細(xì)胞基因突變而來(lái)。其相似點(diǎn)主要表現(xiàn)在以下幾方面［11］:①正常干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都有自我分化能力和分化潛能。②正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞都有對(duì)稱(chēng)分裂與不對(duì)稱(chēng)分裂兩種分裂方式。③正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞有相似的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，而正是其中某些信號(hào)調(diào)節(jié)通路，如 Wnt、Notch、SHH（sonic hedgehog）通路等轉(zhuǎn)導(dǎo)異常最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。④正常干細(xì)胞具有遷移到特定組織和器官的能力，而腫瘤干細(xì)胞有轉(zhuǎn)移的能力。⑤正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞都具有端粒酶活性以及擴(kuò)增的端粒重復(fù)序列，而人類(lèi)終末分化體細(xì)胞不具有端粒酶活性。

與正常乳腺干細(xì)胞相比，乳腺癌干細(xì)胞有自己的特性。表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①正常的乳腺干細(xì)胞的增殖具有穩(wěn)定性，其自我更新具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，增殖和分化處于平衡狀態(tài)，而乳腺癌干細(xì)胞增殖是無(wú)序的、失控的。②與正常的乳腺干細(xì)胞相比，乳腺癌干細(xì)胞缺乏分化成熟的能力，所以包括乳腺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤往往是低分化的。③乳腺癌干細(xì)胞具有積累復(fù)制錯(cuò)誤的傾向，而正常的乳腺干細(xì)胞可通過(guò)多種途徑防止這種情況發(fā)生。④乳腺癌干細(xì)胞在顯微鏡下有腫瘤細(xì)胞形態(tài)，即具有細(xì)胞異型性、細(xì)胞核大、核深染、核分裂等特點(diǎn)，而正常的乳腺干細(xì)胞在形態(tài)上仍為正常細(xì)胞。

3 乳腺癌干細(xì)胞的研究思路

3.1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面 主要在 Notch、Wnt、Hedgehog通路等的研究較多。Notch是通過(guò)與鄰近細(xì)胞上的Notch配體相互作用產(chǎn)生的，是對(duì)多種不成熟細(xì)胞分化的抑制信號(hào)。Dontu等［12］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細(xì)胞中4種配體的表達(dá)均為分化細(xì)胞的2～4倍。隨著細(xì)胞的分化而表達(dá)下調(diào)，Notch信號(hào)的激動(dòng)劑使原代乳腺干細(xì)胞球的體積明顯增加，相反，加入Notch4抗體則明顯變小，甚至完全阻斷了二代細(xì)胞的生長(zhǎng)。Notch途徑與乳腺癌相關(guān)，轉(zhuǎn)導(dǎo)了Notch4胞內(nèi)基因的小鼠乳腺不能正常發(fā)育，也不能在孕期產(chǎn)生乳腺小葉，7個(gè)月內(nèi)即進(jìn)展為低分化腺癌。在人的乳腺癌細(xì)胞系BT474、Hs578T有Notch4胞內(nèi)段的表達(dá)。

Wnt信號(hào)通路在多種生物的胚胎發(fā)育、組織器官形態(tài)、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡中發(fā)揮重要作用，已發(fā)現(xiàn)其在多種干細(xì)胞維持自我更新過(guò)程中發(fā)揮作用，并與多種腫瘤存在密切關(guān)系［13］。Brennan 等［14］實(shí)驗(yàn)表明，缺乏 Wnt/B-catenin通路轉(zhuǎn)錄因子LEF的基因剔除小鼠和表達(dá)Wnt信號(hào)抑制劑Dickkopf的小鼠乳腺均不能發(fā)育。這表明Wnt信號(hào)途徑在乳腺芽胚中對(duì)維持干細(xì)胞池起作用。研究表明，Wnt通路的活化促進(jìn)了乳腺干細(xì)胞的自我更新，引起了乳腺干細(xì)胞比例的增加［15］。乳腺癌干細(xì)胞高表達(dá) Wnt-1、下游分子 β聯(lián)蛋白［16，17］。COMMA-D β-geo（CDβgeo）乳腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 β聯(lián)蛋白后形成乳腺微球體的比例增加。這些結(jié)果表明，Wnt通路的活化可能通過(guò)干擾乳腺干細(xì)胞正常的自我更新，優(yōu)先誘導(dǎo)乳腺干細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致乳腺腫瘤的形成。對(duì)Wnt-1轉(zhuǎn)基因鼠干細(xì)胞比例、干細(xì)胞標(biāo)志物、分化標(biāo)志物的研究支持了這種假說(shuō)。

Hedgehog在乳腺干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞高表達(dá)［18］。Patrawala 等［17］采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中分離出的SP比非SP表達(dá)更高水平的Notch-1。Hedgehog通路中的許多分子被稱(chēng)為癌基因或抑癌基因。這些在乳腺癌的研究中報(bào)道不多，Chang Claude等［19］發(fā)現(xiàn) Ptcl基因的3'端編碼區(qū)存在天然的多態(tài)性，且與口服避孕藥引起的乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。該通路的具體作用機(jī)制尚未完全明確，可能是Ptcl缺失減少了對(duì)Smo的抑制作用，激活Hedgehog信號(hào)途徑，使細(xì)胞進(jìn)入異常的增殖周期，細(xì)胞凋亡減少。

除以上信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑外，尚可存在其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PTEN是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，因與細(xì)胞骨架蛋白tensin同源，而具有抑制侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。Tunici等［20］在小鼠體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞神經(jīng)球中發(fā)現(xiàn)了PTEN的雜合性缺失，首次證明了PTEN很可能與腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

3.2 雌激素及其受體在乳腺癌干細(xì)胞中的作用近年的研究及臨床治療經(jīng)驗(yàn)提示，乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展與雌激素的存在有相關(guān)性。Dontu等［21］提出了乳腺干細(xì)胞發(fā)育模型。胚胎期雌激素受體（estrogen receptor，ER－）乳腺干細(xì)胞產(chǎn)生肌上皮祖細(xì)胞和導(dǎo)管上皮祖細(xì)胞構(gòu)成胚胎期乳腺發(fā)生的基礎(chǔ)，此階段不需雌激素的作用;在胎兒后期，從ER+乳腺干細(xì)胞分化出ER+乳腺祖細(xì)胞，在青春期、懷孕期升高的雌激素水平作用下，ER+乳腺祖細(xì)胞可以產(chǎn)生ER+和ER－瞬時(shí)增殖的細(xì)胞群體，支持乳腺導(dǎo)管的發(fā)育和分支的形成。增殖后，細(xì)胞表面ER表達(dá)下調(diào)，經(jīng)歷進(jìn)一步的分化。由此根據(jù)腫瘤起源將乳腺癌分為三種類(lèi)型:①由最原始的ER－干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，ER+細(xì)胞比例＜10%，表達(dá)導(dǎo)管上皮和肌上皮標(biāo)志，分化差，抗雌激素治療無(wú)效，激素替代治療也不會(huì)增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。②也由ER－干、祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化來(lái)，但尚可分化成ER+細(xì)胞，比例為10%～100%?？勾萍に刂委熆梢种艵R+細(xì)胞的增殖，起初會(huì)使瘤體縮小，但隨著ER－干細(xì)胞繼續(xù)增殖及可能有新的突變下調(diào)ER的表達(dá)，激素治療逐漸失效，激素替代治療不會(huì)對(duì)腫瘤有明顯的影響。③由ER+祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，只表達(dá)管腔上皮表面標(biāo)志，分化好，抗雌激素治療有效，激素替代治療促進(jìn)疾病進(jìn)展。這種模式有助于理解雌激素與腫瘤發(fā)展和治療的關(guān)系，但仍需待分離出純化的乳腺干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞后才能得到直接的驗(yàn)證。

3.3 最新的研究進(jìn)展

3.3.1 細(xì)胞周期蛋白D1 乳腺癌可以分為兩種類(lèi)型:一種是導(dǎo)管癌，這類(lèi)癌對(duì)激素敏感，也是最常見(jiàn)的乳腺癌類(lèi)型，并且生長(zhǎng)緩慢。另一種是基底樣癌，這類(lèi)癌對(duì)激素不敏感，生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移快，預(yù)后差。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺導(dǎo)管癌起源于小葉祖細(xì)胞（小葉祖細(xì)胞是一種能夠產(chǎn)生小葉樣結(jié)構(gòu)，并具有在妊娠期及哺乳期分泌乳汁的作用）;在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制這些小葉祖細(xì)胞的必需蛋白質(zhì)能夠阻止小鼠腫瘤細(xì)胞的形成。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)，這些祖細(xì)胞依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白D1的活性。研究中應(yīng)用帶有無(wú)活性細(xì)胞周期蛋白D1和一種促進(jìn)乳腺導(dǎo)管癌發(fā)生的基因的小鼠模型;引用這個(gè)模型發(fā)現(xiàn)僅有極少數(shù)的小葉祖細(xì)胞生成，而且能避免乳腺導(dǎo)管癌的發(fā)生［22］。由此可以推斷，抑制細(xì)胞周期蛋白D1，或許能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞向乳腺導(dǎo)管癌的發(fā)展。

3.3.2 CXCR1密西根大學(xué)綜合癌癥中心的研究者在研究中發(fā)現(xiàn)，用抗體或者一些小分子物質(zhì)（如repertaxin）抑制細(xì)胞表面蛋白CXCR1，能導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞的衰竭。而腫瘤干細(xì)胞的選擇性衰竭能夠減少腫瘤的生長(zhǎng)或者轉(zhuǎn)移［23］。因此，可以認(rèn)為這兩種物質(zhì)對(duì)腫瘤干細(xì)胞可能有抑制作用。這可能會(huì)成為腫瘤治療中的突破點(diǎn)。

4 乳腺癌干細(xì)胞與臨床

腫瘤干細(xì)胞因能高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，能將化療藥物泵出細(xì)胞外，因此有研究者認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療有抵抗性。同時(shí)，殘留的未被殺死的腫瘤干細(xì)胞也成為復(fù)發(fā)的根源。Giatromanolaki等［24］的研究中發(fā)現(xiàn)，CD44s與CD24的表達(dá)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2、ER、孕激素受體的表達(dá)與血管生成有關(guān)系。Abraham 等［25］的研究認(rèn)為，CD44+/CD24－乳腺癌細(xì)胞與患者的轉(zhuǎn)移有關(guān)系，但是與患者的臨床預(yù)后無(wú)關(guān)系。Mylona等［26］用免疫組化雙染的方法對(duì)136例浸潤(rùn)性乳腺癌的患者進(jìn)行了CD44+/CD24－和CD44－/CD24+與乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系研究，其研究表明CD44+/CD24－與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及腫瘤的分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，與患者的生存率呈正相關(guān);而CD44+/CD24－與臨床病理分級(jí)無(wú)關(guān)系，與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。因此，CD44+/CD24－將會(huì)是乳腺癌干細(xì)胞研究中新的突破點(diǎn)。

5 展望及存在的問(wèn)題

通過(guò)以上的研究可以發(fā)現(xiàn)，許多學(xué)者對(duì)細(xì)胞表面因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素相關(guān)性腫瘤的激素水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，及細(xì)胞周期蛋白對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用作了很多研究，取得了可喜的成果。因腫瘤干細(xì)胞分化的途徑中存在某些特征蛋白或細(xì)胞因子，用這些表面蛋白或者細(xì)胞因子作為抗原，應(yīng)用針對(duì)該抗原的單克隆抗體，針對(duì)性中和細(xì)胞表面抗原（或者細(xì)胞因子）等，改變?nèi)橄侔└杉?xì)胞的微環(huán)境，可能選擇性地阻斷這些蛋白質(zhì)或者細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)生或減輕現(xiàn)有腫瘤的癥狀和腫瘤細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。因此，這種中和細(xì)胞表面蛋白或者相關(guān)細(xì)胞因子的針對(duì)性治療，有望在乳腺癌靶向治療中取得突破性進(jìn)展，并可能在對(duì)乳腺癌的臨床治療和減輕化療不良反應(yīng)方面起到理想的效果。但是，乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)研究仍有很多問(wèn)題存在。乳腺癌干細(xì)胞在乳腺組織中的含量較少，對(duì)于其特異性表面標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)仍存在分歧，分離技術(shù)尚不完全成熟，這將是當(dāng)前科研的主要工作之一。

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