DNA甲基化與結(jié)直腸癌

文 玉（綜述），李曉燕（審校）

（昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650032）

結(jié)直腸癌是較為常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)2007年新增結(jié)直腸癌病例數(shù)為120萬，當(dāng)年因結(jié)直腸癌致死人數(shù)達(dá)60萬［1］。在美國，2010年可能約有569 490人死于癌癥，即每日約有1500人死于癌癥;男性和女性的腫瘤患者在結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均位列第三位［2，3］。結(jié)直腸癌在中國也是最常見的惡性腫瘤之一。結(jié)直腸癌發(fā)病率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期檢測方法。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系是目前研究的熱點。腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中存在一系列甲基化水平的改變，因此，對于某些特異性的異常甲基化的檢測，可成為早期診斷腫瘤的特異分子指標(biāo)。

1 DNA甲基化與表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)的概念是1942年由Waddington提出的。表觀遺傳學(xué)是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。換言之，這種可遺傳的變化是指細(xì)胞內(nèi)除可遺傳信息外的其他可遺傳物質(zhì)的改變，且這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖中能穩(wěn)定地傳遞下去，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和RNA干擾等。表觀遺傳學(xué)是從DNA水平、蛋白質(zhì)水平、染色質(zhì)水平及RNA水平等多個水平調(diào)控基因的表達(dá)［4］，而上述幾個水平之間是相互關(guān)聯(lián)的。

DNA甲基化是目前研究最多、最清楚的一種原核和真核生物普遍存在的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化一般與基因的沉默相關(guān)，非甲基化則一般與基因的活化相關(guān)，而去甲基化往往是與一個沉默基因的重新激活相關(guān)［5］。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，將作為甲基供體的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合到胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過程［6］。研究表明，DNA甲基化是抑制基因活性的一個重要機(jī)制，DNA甲基化是從堿基突變、抑制轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)及染色體的不穩(wěn)定性等方面影響基因表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達(dá)的作用目前研究得較多。

DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制有:①DNA的胞嘧啶發(fā)生甲基化后，DNA的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合;②甲基化的DNA與 CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MeCPs）結(jié)合，改變了染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而抑制了基因的轉(zhuǎn)錄;③序列特異性甲基化連接蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，組織轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響了基因的轉(zhuǎn)錄［7］。

DNMT在甲基化中的作用也不容忽視。目前所知的DNMT有3類（5種），分別是 DNMT1、DNMT2和 DNMT3（DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3L）。DNMT1主要維持甲基化狀態(tài)，是非CpG位點從頭甲基化所必需，并參與甲基化狀態(tài)的延伸，即是復(fù)制后維持甲基化的關(guān)鍵酶［8］。目前對于DNMT2的認(rèn)識尚少，DNMT2在組織內(nèi)主要分布于肌肉、發(fā)育中的胚胎內(nèi)臟、卵巢囊腫及增殖中的睪丸細(xì)胞［9］，研究認(rèn)為其DNA甲基化酶活性非常弱，且識別位點并非CpG，因此在體外實驗中常常難以觀測到其DNA甲基化酶 活 性［10］。DNMT3 包 括 DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L，主要參與從頭甲基化，是從頭甲基化酶，對CpG位點的側(cè)翼序列有一定的傾向性，研究顯示其3種亞型間具有相互影響及協(xié)同作用［11，12］。

2 結(jié)直腸癌中的DNA甲基化改變

正常的DNA甲基化對于維持機(jī)體的功能是必需的，如基因印跡、X染色體失活、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育等［12］，而異常的DNA甲基化則會引發(fā)疾病甚至腫瘤的發(fā)生，異常CpG的重新甲基化常被認(rèn)為是人類腫瘤發(fā)生的一個早期特征［13］。結(jié)直腸癌中，基因不穩(wěn)定性主要分為:微衛(wèi)星不穩(wěn)定、CpG島甲基化表型和癌基因突變［14］。而DNA甲基化多表現(xiàn)為甲基化水平降低（包括整個基因組的廣泛低甲基化、癌基因的低甲基化及未甲基化CpG島的重新甲基化）和某些特定區(qū)域發(fā)生的高甲基化（即區(qū)域性高甲基化）。

2.1 低甲基化 低甲基化通過以下途徑誘發(fā)腫瘤:①低甲基化誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，這些物質(zhì)可插入激活原癌基因;②低甲基化可通過表觀遺傳效應(yīng)激活原癌基因;③低甲基化可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性。有研究表明，在許多腫瘤中，細(xì)胞整體呈現(xiàn)低甲基化水平，隨著病情的惡化，低甲基化程度則會逐漸加強(qiáng)［13］。

2.2 高甲基化 區(qū)域性高甲基化發(fā)生的特定區(qū)域一般為跨越管家基因和腫瘤抑制基因啟動子的CpG島區(qū)，由于其能誘導(dǎo)基因編碼區(qū)突變或使基因失活而利于腫瘤的發(fā)展。目前已經(jīng)鑒定出的在不同腫瘤中易發(fā)生高甲基化的基因包括參與細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、凋亡、DNA錯配修復(fù)、血管生成抑制、腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤、耐藥性形成等基因。而這種基因水平的改變與基因剔除和基因突變等不同，可以被DNMT抑制因子逆轉(zhuǎn)，從而恢復(fù)正常甲基化狀態(tài)［15］。

2.3 結(jié)直腸癌中甲基化異常的基因 1999年，Toyota等［16］在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)了一組高甲基化聚集的特殊CpG島甲基化表型，是多個基因同時發(fā)生轉(zhuǎn)錄失活，引起基因外不穩(wěn)定的一種通路，在結(jié)直腸癌形成的后期起著重要作用。一系列研究表明，結(jié)直腸癌中的5-甲基胞嘧啶較正常組織水平低，而對于p16（即 MTS，multiple tumor suppressor 1）、錯配修復(fù)基因 1（human mutL homolog 1，hMLH1）和 MINT（Msx2 interacting nuclear target protein）位點甲基化水平的檢測發(fā)現(xiàn)，其廣泛低甲基化主要發(fā)生于結(jié)直腸癌早期。廣泛低甲基化可以增加某些基因的表達(dá)水平，如癌基因c-myc、K-ras以及結(jié)直腸癌中S100鈣調(diào)蛋白 A4 基因等［17］。Liu 等［18］報道，在 78% 的結(jié)直腸癌組織中和13%的癌旁組織中檢測出A激酶錨定蛋白 12（A-kinase anchoring protein12，AKAP12）啟動子的甲基化，而近來的一些研究表明，在收集到的結(jié)直腸癌患者和正常人血液中檢測出 AKAP12，各占48%和8%［19］。Okada 等［20］研究認(rèn)為，在結(jié)直腸癌中TWIST1（twist homolog 1）基因超甲基化是較為常見的，而且它的高表達(dá)會進(jìn)一步造成結(jié)直腸癌的惡化。

3 DNA甲基化與結(jié)直腸癌早期診斷、檢測及治療

3.1 結(jié)直腸癌早期診斷 提高結(jié)直腸癌的早期診斷率可以明顯改善臨床整體治療效果，對于患者預(yù)后具有重要意義。很多CpG島甲基化事件已成為腫瘤早期診斷的分子靶標(biāo)，而CpG島超甲基化可能會是一個很有前景的早期診斷腫瘤的指標(biāo)。Esteller等［21］報道，在48例平坦型結(jié)直腸癌患者中的39例檢測到RAS相關(guān)區(qū)域家族1A基因（Ras association domain family 1A gene，RASSF1A）的啟動子超甲基化，結(jié)果顯示RASSF1A的啟動子超甲基化是一個在平坦型結(jié)直腸癌發(fā)病早期的頻發(fā)分子事件，并且隨后一系列RAS基因（Ras gene）轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的異常與平坦型結(jié)直腸癌的形態(tài)和侵襲性有關(guān)。Nishio等［22］認(rèn)為，人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（human runt related transcription factor 3，RUNX3）可作為診斷結(jié)直腸癌的一種新的血清標(biāo)志物。Liu等［23］也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞相關(guān)基因6（nasopharyngeal carcinoma associated gene 6，NGX6）介導(dǎo)的啟動子甲基化是一個潛在的結(jié)直腸癌分子標(biāo)志。Model等［24］運(yùn)用微陣列分析和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析等技術(shù)，篩選出高度甲基化結(jié)直腸癌序列，其中的TMEFF2基因（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin domain gene）、表皮生長因子受體基因和ZDHHC22基因（zinc finger，DHHC domain containing 22）等標(biāo)志物具有高度特異性，并且可用于檢測血液或糞便樣本，可作為結(jié)直腸癌的非侵入性診斷方法［24］。deVos等［25］指出，檢測血漿中的SEPT9基因（septin 9 gene）可用于診斷結(jié)直腸癌，而Huang等［26］在結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本中檢測出分泌型卷曲相關(guān)蛋白2的超甲基化，認(rèn)為其可作為早期診斷結(jié)直腸癌的一種方法［26］。隨著深入研究，DNA甲基化將會在結(jié)直腸癌早期診斷中發(fā)揮重要作用。

3.2 DNA甲基化的檢測方法 檢測DNA甲基化的主要途徑有:①用于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶來鑒別是否甲基化;②因亞硫酸氫鈉可轉(zhuǎn)換未甲基化的胞嘧啶為尿嘧啶，故可用亞硫酸氫鈉處理DNA，則發(fā)生甲基化DNA的胞嘧啶將不被替代。主要的實驗方法有:甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶聯(lián)用Southern印跡雜交（Southern blotting）、限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)、亞硫酸氫鈉處理DNA后測序、甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)、甲基化敏感單核苷酸引物延長法和亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法等。

3.3 DNA甲基化與結(jié)直腸癌的治療 DNA甲基化是可逆的動力學(xué)過程，因此，抑制DNMT成為治療腫瘤的一種研究思路，使用DNMT抑制劑，可使腫瘤中甲基化的基因被重新激活［27］。Xiong 等［28］報道，DNMT的作用機(jī)制在于通過酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子5等信號通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的G2期，繼而發(fā)生凋亡，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。Deng等［29］用5-脫氧氮胞苷處理結(jié)直腸癌的LoVo細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其可重新激活RUNX3的表達(dá)而進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。Hiraki等［30］研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3基因（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3）的CpG島甲基化表型可以用于評價聯(lián)合運(yùn)用替吉奧膠囊（S-1）和鹽酸伊立替康（CPT-11）治療結(jié)直腸癌患者的療效。

4 結(jié)語

隨著基因組測序的完成，表觀基因組學(xué)將成為一個全球性研究熱點。結(jié)直腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而深入研究結(jié)直腸癌DNA甲基化模式可從另一角度反映其基因表達(dá)狀態(tài)，解釋腫瘤的形成和發(fā)展機(jī)制，對早期診斷及治療提供新的思路。近年來，在DNA甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系方面的研究也取得了較多的成果，并隨之出現(xiàn)了很多敏感的檢測甲基化的方法和手段，使得DNA甲基化標(biāo)志物在臨床的應(yīng)用成為可能，而且以表觀遺傳改變?yōu)榘袠?biāo)的治療有望在不久的將來用于臨床，為結(jié)直腸癌的分子治療提供廣闊的前景。

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