3個紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的耐鹽性評價

王 珺，柳小妮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物生產(chǎn)層

3個紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的耐鹽性評價

王 珺，柳小妮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

選取國外耐高溫高濕的3個紫花苜蓿(Medicagosativa)品種：“維多利亞”、“盛世”和“CW787”，用NaCl作選擇劑，采用一步和多步正篩法，篩選出耐鹽愈傷組織變異系，對其再生植株的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量，以及超氧化物歧化酶活性等生理指標(biāo)進行了測定，并采用隸屬函數(shù)法對耐鹽突變材料的抗鹽性進行了綜合評價。結(jié)果表明，經(jīng)篩選得到的耐鹽突變材料的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性均顯著(P<0.05)高于未經(jīng)篩選的對照植株，其耐鹽性大小依次為：“盛世”>“CW787”>“維多利亞”。

紫花苜蓿；耐鹽突變材料；生理生化指標(biāo)；耐鹽性；模糊隸屬法

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題，我國是世界上主要的鹽堿地國家之一，鹽堿地面積約4 000萬hm2，約占陸地總面積的25%，僅海岸帶、灘涂就在667萬hm2以上[1]。近年來，環(huán)境惡化，淡水資源缺乏導(dǎo)致各地鹽堿地增多。紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培利用最廣泛的豆科牧草，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、各類家畜喜食等優(yōu)點，被譽為“牧草之王”，篩選具有高耐鹽特性的紫花苜蓿新品種，是改良和利用鹽堿地的重要途徑。

植物耐鹽新品種選育方法主要包括引種篩選、雜交、細(xì)胞工程和基因工程等。提高作物的耐鹽性，最終決定于2個因子：首先是耐鹽遺傳變異的獲得，其次是耐鹽脅迫下進行較大強度的選擇與篩選[2]。在植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的植物群體中，變異是一種常見的現(xiàn)象。體細(xì)胞無性系變異是基因型依賴性的，即隨基因型不同，變異的數(shù)量和程度也不同。同時其生長過程中培養(yǎng)基里加有不同的激素，對組培的外植體本身就是一種刺激，而且在組培過程中溫度和光照時間恒定與自然生長的條件有差異，為變異提供了可能[3]。充分利用植物離體培養(yǎng)過程中存在的廣泛的體細(xì)胞變異可以很快培育出耐鹽突變體材料。

近年來，對苜蓿耐鹽性的研究也取得了不少成果，并逐漸應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，對一些鹽堿地的改良利用作出了重要貢獻。如采用NaCl 作為選擇壓力，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得了多種植物的耐鹽突變體和耐鹽植株[1，4-5]，在紫花苜蓿耐鹽轉(zhuǎn)基因方面的研究也有不少報道[6]，而細(xì)胞工程技術(shù)相關(guān)研究獲得的耐鹽植株，對其耐鹽能力大小缺乏較為準(zhǔn)確地綜合評價，也存在選擇的耐鹽突變體在抗性、育性、產(chǎn)量、品質(zhì)等方面的不協(xié)調(diào)問題[7]。

植物耐鹽機制是錯綜復(fù)雜的，耐鹽性狀是受多基因控制的，涉及多種生理和代謝途徑。利用耐鹽突變材料生理生化功能上的差別，可為判斷耐鹽變異體提供一些依據(jù)。目前采用生理生化檢測研究主要集中在無機離子積累、游離脯氨酸的變化和蛋白質(zhì)酶的變化等研究方面[8]。本研究選取國外耐高溫高濕的3個紫花苜蓿品種，用NaCl作選擇劑，采用一步和多步正篩法，篩選培育出耐鹽突變材料后，通過對其再生植株的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性的測定，以評價其耐鹽性，并采用隸屬函數(shù)法對其抗鹽性進行了綜合評價，研究結(jié)果對紫花苜蓿耐鹽育種和耐鹽生理機制研究有一定參考價值。

1 研究材料和方法

1.1試驗材料 試驗材料為國外3個耐高溫高濕的紫花苜蓿品種：“維多利亞(Vitoria)”，“盛世(Millennium)”和“CW787”。 試驗種子由北京克勞沃公司提供。

“維多利亞”、“盛世”和“CW787”都喜溫暖半濕潤氣候，具有耐旱、耐高溫的特點，且對苜蓿病蟲害也有較高的抗性，在中國南方種植較廣。“盛世”具較好的耐鹽堿特性，“維多利亞”抗高溫并且耐嚴(yán)寒，“CW787”的抗逆性強。王媛媛等[9]的研究也證明，Millennium紫花苜蓿種子在NaCl溶液濃度小于175 mmol/L時，種子的發(fā)芽率都在90%以上，耐鹽性較好。

1.2試驗方法

1.2.1耐鹽突變材料的篩選與再生 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，在基本愈傷培養(yǎng)基中加入一定濃度的NaCl作為篩選培養(yǎng)基，采用一步正篩法和多步正篩法2種方法。25 ℃下弱光培養(yǎng)。

一步正篩法：取繼代3次以上同一克隆的胚性愈傷組織，分別接種于附加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的NaCl的篩選培養(yǎng)基中。1個月后，挑選生長旺盛的胚性愈傷組織，分成2～3 mm的小塊，轉(zhuǎn)入同樣的篩選培養(yǎng)基中。連續(xù)繼代5次，獲得耐鹽愈傷組織變異系。

1.0%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為植物的臨界鹽濃度，當(dāng)<1.0%時,植株生長狀況良好，>1.0%時,植株生長呈下降趨勢,處于劣勢[10-11]，故選擇NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的植株為耐鹽突變體。

多步正篩法：取繼代3次以上同一克隆的胚性愈傷組織，分別接種于標(biāo)有不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的篩選培養(yǎng)基中，1個月后，挑選生長旺盛的胚性愈傷組織，分成2～3 mm的小塊，轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次升高的篩選培養(yǎng)基中。篩選培養(yǎng)基的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。連續(xù)繼代5次，獲得耐鹽愈傷組織變異系。

經(jīng)一步正篩和多步正篩法篩選后，把生長旺盛、穩(wěn)定的耐鹽愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，將獲得的分化苗移入加生長素NAA的生根培養(yǎng)基中，當(dāng)試管苗出現(xiàn)3條長3～5 cm的根時移栽。

1.2.2耐鹽指標(biāo)的測定 將通過耐鹽篩選獲得材料的再生植株和未經(jīng)篩選的正常植株(CK)，移栽到花盆中，放置于培養(yǎng)室中，溫度為25～28 ℃，待苗恢復(fù)正常生長(約4周)時，每天澆50 mL的自來水，1周后測定指標(biāo)。

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[12]；脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[13]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)方法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[14]。

1.2.3綜合評價 應(yīng)用隸屬函數(shù)值法[15]綜合評價耐鹽突變材料的抗鹽性。采用下列公式計算與抗鹽性呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的指標(biāo)具體隸屬值。

式中，Zij為i種j性狀的耐鹽隸屬值；Xij為i種j性狀值；Ximin為i性狀中最小值；Ximax為i性狀中最大值。將耐鹽隸屬值進行累加，求得平均抗旱隸屬值：

式中，n為指標(biāo)數(shù)隸屬值，其值越大表示耐鹽性越強。

2 結(jié)果與分析

2.1耐鹽突變材料的再生 由于經(jīng)歷了一段長時間的鹽脅迫篩選，耐鹽愈傷組織或細(xì)胞系的分化能力嚴(yán)重喪失，導(dǎo)致耐鹽系難以分化形成再生植株。即使有少數(shù)細(xì)胞分化，也往往出現(xiàn)畸形植株，移植入土壤后的成活率和結(jié)實率極低[16]。本研究獲得的耐鹽突變材料的再生小苗經(jīng)過煉苗，90%的移栽成活(圖1)。

通過一步正篩法獲得的耐鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的NaCl)突變材料的再生植株分別為：“盛世”紫花苜蓿2株，“維多利亞”紫花苜蓿1株。通過多步正篩法獲得耐鹽(1.0%的NaCl)的突變植株分別為：“盛世”紫花苜蓿2株，“維多利亞”紫花苜蓿2株，“CW787”僅1株。

2.2耐鹽愈傷組織變異系的穩(wěn)定性 對耐鹽愈傷組織突變材料進行回接-反回接鑒定，結(jié)果如表1所示。

2種方法篩選出的3個品種的耐鹽愈傷組織突變材料回接到基本培養(yǎng)基中，1個月后存活率上升，但顯著(P<0.05)低于對照的存活率，說明愈傷組織長期在含鹽培養(yǎng)基中受脅迫，其生活力下降。

圖1 耐鹽突變材料再生植株

%

經(jīng)過1個周期的繼代后，活力開始恢復(fù)。將存活的愈傷組織反回接到篩選培養(yǎng)基中，一步正篩法中，愈傷組織存活率略低于一步正篩法篩選5 次(含有1.0%NaCl培養(yǎng)基)的存活率，多步正篩法的愈傷組織存活率低于多步正篩法篩選5 次的存活率，3個品種均有同樣的趨勢?？梢姡徊秸Y法的愈傷組織耐鹽穩(wěn)定性更高，而多步正篩法則可能產(chǎn)生更多生理適應(yīng)性更強的的愈傷組織。

2.3耐鹽植株突變材料的耐鹽生理指標(biāo) 3個品種耐鹽突變材料的MDA含量均高于對照正常植株。其中，“CW787”與“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料與對照正常植株的MDA含量差異均極顯著(P<0.01)；但“盛世”紫花苜蓿品種耐鹽突變材料與對照正常植株之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。說明“CW787”和“維多利亞”紫花苜蓿比“盛世”紫花苜蓿的耐鹽突變材料的膜系統(tǒng)自身調(diào)節(jié)能力好。

所有品種耐鹽突變材料有較高水平的脯氨酸，與對照植株間均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異，其中“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料的脯氨酸含量極顯著(P<0.01)的高于對照植株(表2)，說明“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料的耐鹽性較高。

3個品種對照植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量均低于耐鹽突變材料。其中“CW787”和“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料可溶性糖含量與對照間差異極顯著(P<0.01)，但可溶性蛋白含量差異不顯著(P>0.05)；而“盛世”紫花苜蓿耐鹽突變材料可溶性糖含量與對照差異不顯著(P>0.05)，可溶性蛋白含量相差較大，差異極顯著(P<0.01)(表2)。

鹽分條件下，膜系統(tǒng)的變化分成2個階段：首先，表現(xiàn)為鹽分對膜系統(tǒng)的破壞，也反映其對鹽分的忍耐程度；然后是植物對膜系統(tǒng)的修復(fù)。膜系統(tǒng)的修復(fù)與SOD等酶活性的升高是分不開的[17]。3個品種的耐鹽突變材料的SOD活性均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照植株(表2)，說明3個紫花苜蓿品種的耐鹽突變材料的耐鹽性明顯優(yōu)于未經(jīng)篩選的對照植株。

2.4耐鹽性綜合評價 隸屬函數(shù)綜合評價值反映了各紫花苜蓿品種間的綜合耐鹽能力的大小，數(shù)值越大表明越耐鹽[15]。

耐鹽性綜合評價結(jié)果表明(表3)，3個紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的耐鹽性均優(yōu)于對照植株，說明耐鹽突變材料較正常植株的耐鹽性有所提高。其中，“盛世”紫花苜蓿耐鹽植株的耐鹽性最好，而“CW787”又優(yōu)于“維多利亞”。而在正常對照植株中，“盛世”紫花苜蓿的耐鹽性最差。說明紫花苜蓿通過耐鹽突變篩選，植株自身的機理發(fā)生較大變化，性狀變異明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1紫花苜蓿耐鹽突變材料的篩選 本試驗選取NaCl作為選擇劑，由于單鹽毒害比復(fù)鹽大，用NaCl篩選出的苜蓿品種將更耐鹽，參考相關(guān)資料選用NaCl溶液作為篩選耐鹽突變材料的培養(yǎng)液[18]。篩選方法有多步選擇法和一步選擇法。多步選擇法是選擇劑的濃度從低到高，逐漸增大，周榮仁等[19]就采用這種方法進行煙草(Nicotianatabacum)耐鹽變異體的篩選，并認(rèn)為耐鹽性既包含深度的生理適應(yīng)性，也可能包含某個或某些基因的變異；一步選擇法是一次增加選擇劑濃度，多次選擇的方法，王侖山等[20]用這種方法篩選得到耐鹽1.0%的紫花苜蓿耐鹽愈傷組織，此方法在提高植株分化率方面有一定的效果。鑒于此，本試驗用2種篩選方法篩選紫花苜蓿耐鹽突變材料，并將選擇得到的耐鹽愈傷組織轉(zhuǎn)入無鹽培養(yǎng)基中繼代2次(2個月)，測定了其的耐鹽穩(wěn)定性。結(jié)果表明，3個紫花苜蓿品種在各個繼代周期，多步正篩法愈傷組織存活率均高于一步正篩法?；亟?反回接鑒定表明，一步正篩法的愈傷組織耐鹽穩(wěn)定性更高。

表2 耐鹽突變材料的耐鹽指標(biāo)

注：同指標(biāo)不同大寫字母表示不同品種間或突變材料與CK間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

表3 抗鹽性綜合評價

3.2紫花苜蓿耐鹽變異材料的耐鹽性評價 細(xì)胞膜是活細(xì)胞和環(huán)境之間的界面與屏障，各種不良環(huán)境對細(xì)胞的影響往往首先作用于生物膜[21]。一般說來鹽脅迫處理后，耐鹽品種細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度小，主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜透性小。而敏感品種細(xì)胞膜系統(tǒng)受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為細(xì)胞膜透性大[22]。MDA作為脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，其含量的高低是反映膜脂過氧化作用強弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強弱[23]。孫雷心[24]在試驗中發(fā)現(xiàn)隨著低溫時間的加長，植物體內(nèi)·O2-自由基濃度不斷增加，加劇膜脂過氧化，植物本身清除·O2-能力下降，導(dǎo)致MDA含量上升，從而使膜結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞。本試驗中，3個紫花苜蓿品種的耐鹽突變材料的MDA含量都高于對照植株，說明耐鹽突變材料的抗逆境生長狀況要好于對照植株。

脯氨酸是植物體內(nèi)有效的滲透調(diào)節(jié)劑之一，脯氨酸的積累是植物體抵抗?jié)B透脅迫的有效方式之一[25]。大量研究表明，許多植物在鹽脅迫下脯氨酸迅速積累。周榮仁等[19]篩選出的煙草耐鹽細(xì)胞系中，脯氨酸含量比原始型高出10倍，認(rèn)為這可能是細(xì)胞滲透勢降低，耐鹽能力提高的原因之一。這些結(jié)果提供了比較直接的關(guān)于脯氨酸與耐鹽性相關(guān)的證據(jù)。本試驗結(jié)果也表明耐鹽突變材料的脯氨酸含量都高于對照植株，說明脯氨酸參與了植物組織對鹽脅迫的調(diào)節(jié)。這與王侖山等[20]報道的即使在無鹽壓下，耐鹽變異體的脯氨酸含量也高出對照數(shù)倍的結(jié)論一致。

植物為了適應(yīng)逆境條件，會主動積累一些可溶性糖和蛋白，降低滲透勢和冰點，以適應(yīng)外界環(huán)境條件變化?？扇苄蕴鞘呛芏喾躯}生植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑[26]，它也是合成別的有機溶質(zhì)的碳架和能量來源，對細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體亦有穩(wěn)定作用，還可在細(xì)胞內(nèi)無機離子濃度高時起保護酶類的作用[27]。鹽脅迫下，植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降，主要由于鹽抑制了蛋白質(zhì)的合成和蛋白質(zhì)水解的緣[28]。研究表明，可溶性蛋白與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢有關(guān)，高含量的可溶性蛋白可幫助維持植物細(xì)胞較低的滲透勢以抵抗逆境帶來的脅迫[29]。而SOD普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子·O2-自由基的酶[30]，可以提高植物適應(yīng)逆境的能力。

從本研究結(jié)果中可以看出：紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的可溶性糖、可溶性蛋白含量都顯著高于對照植株，由此說明耐鹽突變材料具有一定的耐鹽性。而且耐鹽突變材料的酶活性也均高于對照植株，高的保護酶活性可有效地減輕膜的損害，緩解鹽害，這也是耐鹽變異體具有一定耐鹽性的重要指標(biāo)。

但植物的抗逆性不僅是一個受多種因素影響的復(fù)雜的數(shù)量性狀，且不同品種的抗逆機制也不盡相同，從而使得不同品種在逆境條件下對某一具體指標(biāo)的反應(yīng)也不盡相同。因而用單一指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確地反映植物品種抗逆性的強弱，應(yīng)用多種指標(biāo)來綜合評價植物對逆境的適應(yīng)能力[30]。但評價植物抗逆性的指標(biāo)較多，指標(biāo)間又存在著一定的相關(guān)性，使得它們所提供的植物對逆境反映的信息發(fā)生交叉與重疊，且各指標(biāo)在綜合評價時的重要性(權(quán)重)也不同，如果直接利用這些指標(biāo)來綜合評價植物的抗逆性則會對結(jié)果造成偏差。隸屬函數(shù)分析提供了一條在多指標(biāo)測定基礎(chǔ)上對材料特性進行綜合評價的途徑，提高了耐鹽性鑒定的可靠性。用隸屬函數(shù)法對3個紫花苜蓿品種的耐鹽性進行綜合評價，結(jié)果表明為“盛世”紫花苜蓿耐鹽突變材料耐鹽性最高，“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料的耐鹽性最小，“CW787”居中。說明利用NaCl作為選擇劑，所獲得的耐鹽突變材料的耐鹽性明顯提高。

國內(nèi)外的研究人員經(jīng)過多年的努力，通過常規(guī)育種、耐鹽突變選擇、細(xì)胞工程技術(shù)等手段，選育出一些耐鹽苜蓿。如由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所育成的耐鹽紫花苜蓿新品種“中苜1、2、3號”，已逐漸應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。但在南方高溫、高濕區(qū)，仍主要依賴苜蓿品種進口，而且對大面積的灘涂地的改良利用尚在探索階段。本研究以國外的3個耐高溫、高濕的紫花苜蓿為材料，以NaCl作為選擇劑，篩選出的耐鹽突變體材料，經(jīng)再生移植后生長良好，而且其MDA、脯氨酸、可溶性糖和蛋白，以及SOD這些生化物質(zhì)含量的增加，在盆栽試驗階段，尚未對其生長有不利的影響。

本研究建立的高頻率分化實驗體系，以及所篩選的具有一定耐鹽性的突變體材料，對充分利用鹽堿地，保證生態(tài)安全有重大作用。下一步的研究重點主要是通過澆鹽處理，深入評價耐鹽突變材料在鹽脅迫下的生理生化指標(biāo)的變化，同時對耐鹽突變材料的耐鹽遺傳特性進行研究，為耐鹽新品系的選擇奠定基礎(chǔ)。

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Evaluationonsalttolerancetosalt-tolerantvariantmaterialsofthreealfalfavarieties

WANG Jun, LIU Xiao-ni

(College of Pratacultural Science, Key Laboratory of Grassland Ecology System, Ministry of Education, Gansu Agricultural University； U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Gansu Lanzhou 730070, China)

Three foreign alfalfa(Medicagosativa) varieties (Victoria, Millennium, and Cw787) with strong resistance to high temperature and humidity were selected to obtain salt-tolerant callus variants by using sodium chloride (NaCl) as selective reagent via positive selection (direct selection and continuous selection) methods. The physiological indexes, including MDA, proline, soluble protein and soluble sugar content, as well as superoxide dismutase (SOD) activity of regeneration plants of callus variants were measured and these physiological indexes was used to comprehensively evaluate the salt tolerance by Subordinate Function method. The results of this study showed that the MDA, proline, soluble protein and soluble sugar content, as well as superoxide dismutase (SOD) activity of regeneration plants of callus variants were significantly (P<0.05) higher than that of control plants. The order of salt tolerance was Millennium > CW787> Victoria.

alfalfa； salt-tolerant material； physiological and biochemical indexes； salt-resistant； subordinate function method

S551+.703.4；Q945.78

A

1001-0629(2011)01-0079-06

2010-01-25 接受日期：2010-05-14

國家科技支撐計劃“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆苜蓿和飼料作物新品種選育項目(2006BAD04A04-01)”

王珺(1985-)，女，甘肅蘭州人，在讀碩士生，主要從事牧草與草坪草種質(zhì)資源研究。

E-mail:aminta0627@sina.com

柳小妮 E-mail:liuxn@gsau.edu.cn