高效液相色譜法測(cè)定清涼膏中鹽酸小檗堿含量*

呂游春，劉幸平，張興德

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，210046)

清涼膏是名老中醫(yī)丁澤民教授的經(jīng)驗(yàn)方，由青黛、血竭、乳香、沒(méi)藥、黃連、冰片等組成，為南京市中醫(yī)院醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號(hào):Z04000824)，已應(yīng)用二十余年，臨床療效佳［1］。但原標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有規(guī)定含量測(cè)定方法，質(zhì)量控制手段過(guò)于簡(jiǎn)單，制劑質(zhì)量難以保證。為有效控制制劑質(zhì)量，筆者以具有清熱燥濕、瀉火解毒功效的黃連為研究對(duì)象，并建立高效液相色譜法［2-3］測(cè)定其主要成分鹽酸小檗堿含量，為建立該制劑有效的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SPD-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津公司)，HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng))，索氏提取器(東方科儀)。

1.2 試藥 清涼膏(規(guī)格:每盒30 g，批號(hào):081124)，鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):110713-200208)。乙腈為色譜純(MERCK公司)，磷酸為分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:AKZONOBEL Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)。流動(dòng)相:乙腈∶0.1%磷酸(25∶75)，柱溫為30 ℃，流速:1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng):345 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品約6.08 mg，精密稱(chēng)定后置100 mL量瓶，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品母液。精密量取2 mL對(duì)照品母液置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為12.16μg·mL-1的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取清涼膏5 g，精密稱(chēng)定，用濾紙包裹后放入索氏提取器中，加甲醇100 mL，提取4 h后，將提取液過(guò)濾濃縮，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度。

2.4 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 按照處方組成，稱(chēng)取除黃連以外的其余藥味并按照制備工藝制成缺黃連的陰性制劑，同供試品溶液的制備方法制備成陰性供試液。精密移取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試液各10μL，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，在陰性供試液的色譜圖中鹽酸小檗堿相應(yīng)的保留時(shí)間(17.487 min)處無(wú)色譜峰，說(shuō)明陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾(圖1)。

圖1 3種溶液的HPLC色譜圖A.陰性對(duì)照品溶液;B.鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液;C.供試品溶液;1.鹽酸小檗堿

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 取對(duì)照品母液，分別稀釋成3.04，6.08，12.16，24.32 和 48.64 μg·mL-1對(duì)照品溶液，分別精密移取10μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，得到線(xiàn)性回歸方程:Y=25 352X+36 678(r=0.999 9)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在3.04～48.64μg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為12.16μg·mL-1鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液10μL，依法測(cè)定5次，RSD為1.68%(n=5)。結(jié)果表明進(jìn)樣的精密度及儀器精密度均較好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液分別于0，2，4，8，12和24 h測(cè)定，RSD為2.19%。結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同批供試品(批號(hào):081124)，平行5份，按供試品溶液同法制備，精密吸取10μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。RSD為2.72%(n=5)。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量重復(fù)性項(xiàng)下的樣品(批號(hào):081124，含量:29.3 μg·g-1)，平行5 份，分別精密加入濃度為145.92μg·mL-1鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0.5 mL，按“2.3”項(xiàng)方法處理，具體結(jié)果見(jiàn)表1。平均加樣回收率100.86%，RSD=1.80%。

2.10 樣品含量測(cè)定 分別取10批清涼膏制劑約5 g，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)方法處理樣品，照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果10批樣品鹽酸小檗堿含量分別為 29.1，29.4，30.1，28.3，27.6，28.5，30.6，31.1，30.2，28.1 μg·g-1，平均含量 29.3 μg·g-1。

3 討論

筆者曾對(duì)多種流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明乙腈∶0.1%磷酸為25∶75時(shí)，各色譜峰能達(dá)到很好的分離且峰形好。制劑樣品處理常采用超聲提取法、熱回流法等常規(guī)提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索氏提取法比較適合樣品的處理。此方法使軟膏連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┹腿?，既?jié)約溶利萃取效率又高。

含量測(cè)定時(shí)樣品常采用高速離心或微孔濾膜過(guò)濾等方法進(jìn)行處理，但由于清涼膏基質(zhì)中含有凡士林、液體石蠟等油性成分，易溶于有機(jī)溶劑，較難除盡，而干擾制劑的含量測(cè)定。參考文獻(xiàn)的處理方式［4-7］，采用冷藏方法進(jìn)行脫脂效果較好。

［1］ 鄭雪平，王業(yè)皇，丁義江，等.清涼膏治療腫痛型外痔的臨床觀察［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(8):719.

［2］ 馬云淑，阮志國(guó)，曾德軍.黃連解毒滴丸中主要有效成分的含量測(cè)定［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2000，27(5):228-229.

［3］ 王靜，陸兔林，毛春芹，等.巖黃連藥材的提取工藝研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(3):360-363.

［4］ 尹寧寧，林永強(qiáng)，徐麗華.高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定冰黃軟膏中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，4，(9):145-146.

［5］ 陳萬(wàn)里，史蕙.高效液相色譜法測(cè)定膚痔清軟膏中鹽酸小檗堿含量［J］.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，29(2):143-144.

［6］ 管慧，李永江，馬建紅.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃連軟膏中鹽酸小聚堿的含量［J］.新疆中醫(yī)藥，2007，25(4):81-83.

［7］ 許明哲，尹利輝，胡昌勤.HPLC法測(cè)定他克莫司軟膏劑含量及含量均勻度［J］.中國(guó)抗生素雜志，2005，30(12):748-751.