怡心健腦軟膠囊的質(zhì)量控制*

章曙丹，姜建民，楊明華，聶磊

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院藥物分析研究所，濟(jì)南 250012;2.浙江省中藥研究所中成藥研究室，杭州 310023)

怡心健腦軟膠囊是新型中藥復(fù)方制劑，由五味子、續(xù)斷、川芎、石菖蒲、益智、黃芪、柏子仁等多味中藥組成，具有補(bǔ)氣安神、益智健腦的功效。為有效控制該制劑的質(zhì)量，筆者對(duì)川芎、石菖蒲、益智、五味子、黃芪、續(xù)斷進(jìn)行薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)鑒別，并采用高效液相色譜(HPLC)法測定五味子醇甲和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀，VWD檢測器;PerkinElmer Lamda 20 UV/VIS分光光度儀;Dikma C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，AB204-S電子分析天平(METTLER TOLED公司);KQ-3200B型超聲波清洗器。

1.2 試藥 乙腈(TEDIA公司，色譜純)，水為純化水，其余試劑均為分析純。怡心健腦軟膠囊樣品4批(批號(hào):20090704，20091204，20091205，20091206)均為本所制劑室自制，規(guī)格:每瓶25 g。

1.3 對(duì)照品及對(duì)照藥材 五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):110857-200406，供含量測定用)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品(批號(hào):111685-200401，供含量測定用)，黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào):110781-200512)，五味子對(duì)照藥材(批號(hào):120922-200606)，川芎對(duì)照藥材(批號(hào):120918-200608)，石菖蒲對(duì)照藥材(批號(hào):121098-200403)，續(xù)斷對(duì)照藥材(批號(hào):121033-200608)，益智對(duì)照藥材(批號(hào):121029-200503)，五味子甲素(批號(hào):764-9201)，五味子乙素(批號(hào):765-9202)均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 川芎、石菖蒲的TLC鑒別 取本品(批號(hào):20090704，下同)1 g，置試管中，加乙酸乙酯5mL，超聲提取20 min，放冷，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取川芎對(duì)照藥材和石菖蒲對(duì)照藥材各1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照TLC法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)(下同)實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷—乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(波長365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

圖1 川芎和石菖蒲TLC色譜圖1.缺川芎陰性樣品;2.川芎對(duì)照藥材;3～4，9～10.樣品(甲醇提取);5～6.樣品(乙酸乙酯提取);7.缺石菖蒲陰性樣品;8.石菖蒲對(duì)照藥材Fig．1 TLC of rhizoma chuanxiong and rhizoma acori tatarinow ii1.negative control without rhizoma chuanxiong;2.rhizoma chuanxiong standard;3-4，9-10.test samples(extracted by methanol);5-6.samples(extracted by ethyl acetate);7.negative control without rhizoma acori tatarinowii;8.rhizoma acori tatarinowii standard

2.1.2 黃芪和續(xù)斷的TLC鑒別 供試品溶液制備:取本品1.0 g，精密稱定，置蒸發(fā)皿中，加水20 mL溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加水飽和乙醚萃取2次，每次20 mL，棄去萃取液，水層用水飽和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并萃取液，加氨試液清洗2次，每次40 mL，正丁醇液再用水清洗2次，每次40 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，搖勻，用孔徑0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。另取黃芪甲苷對(duì)照品和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，分別加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取續(xù)斷對(duì)照藥材，照《中華人民共和國藥典》續(xù)斷項(xiàng)下的TLC鑒別方法制備對(duì)照藥材溶液。吸取上述供試品溶液10，30μL、對(duì)照品溶液2μL、對(duì)照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，紫外光燈(365 nm)下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

圖2 黃芪和續(xù)斷TLC色譜圖1.缺黃芪陰性樣品;2.黃芪甲苷對(duì)照品;3～4.樣品30μL;5.缺續(xù)斷陰性樣品;6.川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品;7.續(xù)斷對(duì)照藥材;8～9.樣品10μLFig．2 TLC of radix astragali and radix dipsaci1.negative control without radix astragali;2.astragalosideⅣstandard;3-4.test samples;5.negative control without radix dipsaci;6.asperosaponinⅥstandard;7.radix dipsaci standard;8-9.tenμL samples

2.1.3 益智的TLC鑒別 取樣品揮發(fā)油0.4 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取益智對(duì)照藥材，照《中華人民共和國藥典》益智項(xiàng)下的TLC鑒別方法制備對(duì)照藥材溶液。吸取上述供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，紫外光燈(365 nm)下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾，見圖3。

2.1.4 五味子的TLC鑒別 取本品1 g，加甲醇5 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取五味子甲素、五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取五味子對(duì)照藥材，照《中華人民共和國藥典》2010年版五味子項(xiàng)下的TLC鑒別方法制備對(duì)照藥材溶液。吸取上述供試品溶液10μL、對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶7∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，紫外光燈(波長254 nm)下顯相同顏色的熒光萃滅斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾，見圖4。

圖3 益智TLC鑒別色譜圖1.缺益智陰性樣品;2.益智對(duì)照藥材;3～4.樣品Fig．3 TLC of fructus alpiniae oxyphyllae1.negative control without fructus alpiniae oxyphyllae;2.fructus alpiniae oxyphyllae standard;3-4.samples

圖4 五味子TLC色譜圖1.缺五味子的陰性樣品;2.五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品;3～4.樣品;5.五味子對(duì)照藥材Fig．4 TLC of fructus schisandrae chinensis1.negative control without fructus schisandrae chinensis;2.standard of schizandrin， deoxyshisandrin and γ-schisandrin(upwards);3-4.samples;5.fructus schisandrae chinensis standard

2.2 含量測定

2.2.1 五味子醇甲的含量測定

2.2.1.1 測定波長的確定 取五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇溶解，稀釋至一定刻度，置紫外/可見分光光度儀中，在190～400 nm之間掃描，繪制紫外吸收光譜。結(jié)果表明五味子醇甲在250 nm處有最大吸收。因此，測定波長定為250 nm。

2.2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:Dikma C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈∶水，梯度洗脫0 ～14 min，乙腈45%;～22min，乙腈65%;～30 min，乙腈45%。流速:1 mL·min-1;檢測波長:250 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:對(duì)照品溶液5μL，、供試品溶液20μL。保留時(shí)間:約為13 min。色譜圖見圖5。

圖5 五味子醇甲陰性對(duì)照品、對(duì)照品和供試品的HPLC色譜圖A.陰性對(duì)照品;B.對(duì)照品;C.供試品;1.五味子醇甲Fig．5 HPLC chrom atogram of schisandrin negative reference substance，reference substance and sam pleA.negative reference substance;B.reference substance;C.sample;1.schizandrin

2.2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取真空干燥至恒質(zhì)量的五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含160μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.1.4 供試品溶液制備 取本品(批號(hào):20090704，下同)0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定，超聲提取30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量。搖勻，用孔徑0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.5 檢測限及最小檢出量的測定 取對(duì)照品溶液:五味子醇甲0.16 mg·mL-1稀釋25倍。進(jìn)樣，測定，檢測限為3.20 ng;最低定量限為16.00 ng。

2.2.1.6 提取方法比較 取本品0.8 g，精密稱定，精密加入甲醇30 mL，稱定，分別采用超聲波提取法和回流法提取30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量。搖勻，用孔徑0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，測得超聲法和回流法提取的五味子醇甲含量分別為1.60和1.57 mg·g-1。結(jié)果表明超聲提取法較好。

2.2.1.7 提取時(shí)間比較 取本品0.8 g，精密稱定，精密加入甲醇30 mL，稱定，分別超聲提取20，30，40 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量。搖勻，用孔徑0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，測得五味子醇甲含量分別為1.53，1.57，1.57 mg·g-1。結(jié)果表明超聲30 min可提取完全。

2.2.1.8 線性范圍考察 精密稱取五味子醇甲適量，加甲醇溶解并分別制成 0.008，0.016，0.032，0.064，0.096，0.128，0.160 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求得回歸方程為 Y=1 322.770 0X-5.282 2，r=0.999 96，結(jié)果表明五味子醇甲在0.080～1.600μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.9 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣測定5次，測得五味子醇甲峰面積分別為845.5，864.5，865.0，850.3，852.5，平均峰面積為 855.6，RSD=1.02%。

2.2.1.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取本品供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h 進(jìn)行測定，結(jié)果測得五味子醇甲含量分別為 1.56，1.58，1.60，1.60，1.62，1.62 mg·g-1，平均含量為1.60 mg·g-1，RSD=1.40%。說明供品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取本品6份，精密稱定，按供試品液制備方法處理，按上述色譜條件測定。結(jié)果五味子醇甲平均含量1.58 mg·g-1，RSD=0.51%(n=6)。

2.2.1.12 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的本品0.4 g，共6份，分別加入五味子醇甲對(duì)照品溶液(濃度為0.65 mg·mL-1)1 mL，再精密加入甲醇29 mL，按上述方法制成供試品溶液，依法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果五味子醇甲平均加樣回收率99.56%，RSD 0.82%，見表1。

表1 五味子醇甲加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 Results of recovery of schisandrin n=6

2.2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量測定

2.2.2.1 測定波長的確定 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，加甲醇溶解，稀釋至一定刻度，置紫外/可見分光光度儀中，在190～400 nm之間掃描，繪制紫外吸收光譜。結(jié)果表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ在212 nm處有最大吸收。因此，測定波長定為212 nm。

2.2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:Dikma C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm，迪馬公司);流動(dòng)相:乙腈:水，梯度洗脫:0～13 min，乙腈28%;～20 min，乙腈40%;～30min，乙腈28%。流速:1mL·min-1;檢測波長:212 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:對(duì)照品溶液5μL、供試品溶液10μL。保留時(shí)間約13 min。色譜圖見圖6。

2.2.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取真空干燥至恒質(zhì)量的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含920μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

圖6 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照品的HPLC色譜圖A.陰性對(duì)照品;B.對(duì)照品;C.供試品;1.川續(xù)斷皂苷ⅥFig．6 HPLC chromatogram of asperosaponin Ⅵ，sam p le and negtive controlA.negative control;B.reference substance;C.sample;1.asperosaponinⅥ

2.2.2.4 供試品溶液制備 同“2.1.2”。

2.2.2.5 檢測限及最小檢出量的測定 取對(duì)照品溶液:川續(xù)斷皂苷Ⅵ0.92 mg·mL-1稀釋50倍。進(jìn)樣，測定，檢測限為0.092 ng;最低定量限為0.460 ng。

2.2.2.6 提取方法比較 取本品1.0 g，精密稱定，分別比較了①正丁醇回流提取，提取液合并，水洗4次;②樣品正丁醇回流提取后，水洗4次，上聚酰胺柱;③樣品水溶解后正丁醇萃取，水洗4次;④樣品水溶解后正丁醇萃取，氨試液清洗，水洗等方法。結(jié)果前面3種方法制備的樣品溶液在定容時(shí)均有較厚油脂層，導(dǎo)致無法精確定容。而用最后一種方法制備的供試液不存在此問題，顯示氨試液對(duì)本品的清洗效果優(yōu)良。

2.2.2.7 提取次數(shù)比較 對(duì)本品正丁醇萃取次數(shù)進(jìn)行了比較，分別萃取3，4，5次，測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量分別為1.90，1.97，1.98 mg·g-1。表明萃取 4 次即可提取完全。

2.2.2.8 線性范圍考察 精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ適量，加甲醇溶解并分別制成 0.092，0.184，0.368，0.552，0.736，0.920，1.104 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求得回歸方程為Y=104.82X-1.090 5，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9，結(jié)果表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ在0.92～11.04μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.9 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣測定5次，進(jìn)樣量10μL，測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積分別為576.2，577.1，578.2，577.1，576.5，平均峰面積為577.0，RSD=0.13%。

2.2.2.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取本品1.0 g，精密稱定，按上述方法制成供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)行測定，結(jié)果測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量分別為2.00，2.05，2.03，2.03，2.05，2.08 mg· g-1，平 均 含 量 為2.04 mg·g-1，RSD=1.32%。說明供品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取本品6份，精密稱定，按供試品液制備方法處理，進(jìn)樣量為10μL，按上述色譜條件測定。結(jié)果川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均含量為2.04 mg·g-1，RSD=1.80%(n=6)。

2.2.2.12 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的本品0.5 g，取6份，分別加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液(濃度1.089mg·mL-1)1mL，揮去甲醇，按上述方法制成供試品溶液，依法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均加樣回收率99.49%，RSD2.69%，見表2。

表2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Results of recovery of asperosaponin Ⅵ

2.2.3 揮發(fā)油測定 取本品100 g，置圓底燒瓶中，加水250 mL，照揮發(fā)油測定法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄Ⅹ D)實(shí)驗(yàn)，提取揮發(fā)油。結(jié)果3批樣品的揮發(fā)油含量分別為(V/W)0.92%，0.86%，0.82%。

2.2.4 樣品測定 取樣品3批(批號(hào):20091204，20091205，20091206)，按供試品溶液制備方法制備供試液，依上述色譜條件測定并計(jì)算供試品中五味子醇甲和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。結(jié)果3批樣品中五味子醇甲的含量依次為 1.66，1.63，1.67 mg·g-1，RSD 值依次為0.15%，0.24%，0.59%(n=3)。樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量依次為 1.81，1.88，1.95 mg·g-1，RSD值依次為0.42%，0.53%，0.45%(n=3)。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇 本文兩個(gè)含量測定指標(biāo)均采用梯度洗脫以提高分析效率。五味子醇甲的分離先后試用過不同比例的甲醇-水［1-3］、甲醇-乙腈-水［4-6］等多種溶劑系統(tǒng)，分離效果均不滿意，經(jīng)摸索后采用乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)分離效果明顯改善。

3.2 含量測定指標(biāo)的選擇 根據(jù)工藝特點(diǎn)，分別選用脂溶性部分的五味子醇甲和水提部分的川續(xù)斷皂苷Ⅵ為含量測定項(xiàng)目。另外，對(duì)方中所有潛在的含測指標(biāo)均進(jìn)行了研究:如:黃芪甲苷和川芎中的阿魏酸等，含量均太低;五味子甲素和五味子乙素的色譜峰保留時(shí)間長，峰形不佳，含量也很低，故未將它們列入標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 川芎與石菖蒲、黃芪與續(xù)斷的薄層鑒別 分別采用同一展開系統(tǒng)，特征斑點(diǎn)分離良好。上述4味藥材的鑒別尤其在低濕度條件下斑點(diǎn)更為圓整。由于樣品油脂較多，黃芪與續(xù)斷的薄層鑒別經(jīng)氨試液清洗除雜［7-9］，能減輕譜帶底色，消除斑點(diǎn)拖尾，同時(shí)配合較長展距達(dá)到較好分離。方中益智的鑒別曾采用《中華人民共和國藥典》(2010年版)的顯色方法，雖嘗試不同展開劑，但都存在特征斑點(diǎn)與陰性樣品中五味子乙素的斑點(diǎn)相互干擾的問題，采用10%硫酸乙醇為顯色劑，加熱至顯色清晰后置365 nm下檢視，綠色熒光斑點(diǎn)清晰靈敏，專屬性強(qiáng)。而五味子的鑒別則采用五味子醇甲和甲素為指標(biāo)，并將五味子甲素展開系統(tǒng)的比例進(jìn)行了調(diào)整，以提高五味子醇甲的Rf值，從而同時(shí)鑒別兩個(gè)指標(biāo)。

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