蘭索拉唑片的生物等效性研究*

張悅，張愛(ài)麗，李穆瓊，王寶龍，秦向陽(yáng)，李曉曄，孫曉莉，文愛(ài)東

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，西安 710032;2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032)

蘭索拉唑(lansoprazole)，化學(xué)名為2-{［3-甲基-4-(2，2，2-三氟乙氧基)-2-吡啶基］甲基}亞磺?；?1H-苯并咪唑，是新型的抑制胃酸分泌的藥物，它作用于胃壁細(xì)胞的H+-K+-ATP酶［1］，使壁細(xì)胞的H+不能轉(zhuǎn)運(yùn)到胃，以致胃液中胃酸量顯著減少，臨床上用于十二指腸潰瘍、胃潰瘍、反流性食管炎及佐-艾(Zollinger-Ellison)綜合征(胃泌素瘤)的治療，療效顯著，對(duì)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)有抑制作用［2］。蘭索拉唑與奧美拉唑結(jié)構(gòu)類似，其藥理活性也相似。但蘭索拉唑因在吡啶環(huán)4位側(cè)鏈導(dǎo)入氟并有三氟乙氧基取代基，使其生物利用度較奧美拉唑提高＞30%，親脂性也強(qiáng)于奧美拉唑，因此本品在酸性條件下可迅速地透過(guò)壁細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)榇位撬岷痛位酋Ｑ苌锒l(fā)揮藥效，對(duì)Hp的抑菌活性提高為奧美拉唑的4倍［3-5］。筆者對(duì)武漢中聯(lián)集團(tuán)四藥藥業(yè)有限公司仿制藥蘭索拉唑建立高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)，并研究其生物等效性。

1 材料與方法

1.1 儀器 Dionex summit 680高效液相色譜儀，Dionex P680 HPLC PUMP，Thermostatted Column Compartment， PDA-100 photodiode Array Detector，Chromeleon工作站;H-1微型混合器(上?？岛坦怆妰x器有限公司);超聲儀 KUDOS SK8200 LH，離心機(jī)Anke TGL-16 C，真空泵(鄭州杜甫儀器廠詩(shī)圣SHB-3循環(huán)水多用真空泵)，S2-93自動(dòng)雙重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 蘭索拉唑?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100709-200501);受試制劑:蘭索拉唑片，武漢中聯(lián)集團(tuán)四藥藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每片30 mg，批號(hào):20090301;參比制劑:蘭索拉唑片(可意林)，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每片15 mg。批號(hào):09090601;內(nèi)標(biāo):奧美拉唑(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100367-200702)。乙腈、甲醇均為色譜純(Calepure Promptar Company Ltd.)，磷酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、乙酸乙酯、三乙胺均為分析純(天津市富寧精細(xì)化工有限公司);實(shí)驗(yàn)雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制;空白血漿及人體服藥后血漿均由第四軍大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科提供。

1.3 色譜條件 色譜柱:Aglient C18(250 mm×5 mm，5μm);柱溫:40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):285 nm;流速:1.0 mL·min-1;流動(dòng)相:乙腈-1‰三乙胺水溶液(磷酸調(diào)pH至7.0)=30∶70。進(jìn)樣量:20μL。

1.3.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘭索拉唑?qū)φ掌?0 mg，置于10mL棕色量瓶，并用混合液(0.1 moL·L-1碳酸鈉溶液∶甲醇=50∶50)溶解定量至刻度線，得濃度為1 mg·mL-1的貯備液。再用混合液稀釋成濃度分別為0.10，0.01 mg·mL-1蘭索拉唑溶液。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)液的配制 精密稱取奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)品7 mg于10 mL棕色量瓶，混合液稀釋至刻度線，振搖得濃度為0.7 mg·mL-1的奧美拉唑溶液。再用甲醇稀釋至濃度為0.07 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)液。

1.4 受試者選擇 20例健康男性志愿者，年齡18～40歲，體質(zhì)量57.0～66.5 kg，經(jīng)過(guò)體檢為健康者。血尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖均正常;無(wú)同類藥物過(guò)敏史;受試者試驗(yàn)前2周不服用其他任何藥物;試驗(yàn)期間禁忌煙、酒、茶等;受試者自愿受試且簽訂知情同意書，并經(jīng)過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5 給藥與血樣采集 試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)二階段交叉設(shè)計(jì)自身對(duì)照試驗(yàn)方法。受試者禁食12 h后，清晨空腹給藥，用溫開(kāi)水吞服，服藥后4 h進(jìn)統(tǒng)一食譜的標(biāo)準(zhǔn)餐。第一階段A組服用受試制劑，R組服用參比制劑。受試者口服藥物前抽取空白血樣4 mL，在服藥后0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0和12.0 h分別采集靜脈血4 mL，血漿置無(wú)菌試管中，于-20℃ 保存。第二階段A組服用參比制劑，R組服用受試制劑。其余方法與第一階段相同。全部過(guò)程在臨床醫(yī)師的監(jiān)督指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.6 血樣處理方法 精確吸取1 mL血漿樣品置10 mL離心管中，加入0.07 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)20μL及0.01 moL·L-1氫氧化鈉、0.1 moL·L-1碳酸鈉溶液各100μL，渦旋3 min，靜置10 min。移取乙酸乙酯4 mL加入試管內(nèi)，渦旋混勻 3 min，離心 10 min(3 500 r·min-1)。將上清液全部移取至置潔凈試管中，氮?dú)?7℃吹干。加入30%乙腈溶液300μL溶解殘?jiān)?，渦旋混勻1 min，離心3 min(3 500 r·min-1)后取上清液20μL進(jìn)樣分析。

1.7 介質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 遞質(zhì)效應(yīng)主要用于考察血漿內(nèi)源性和其他代謝物對(duì)樣品測(cè)定的干擾，以保證待測(cè)的物質(zhì)是預(yù)期的分析物。本試驗(yàn)通過(guò)考察空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖以及用藥后的生物樣品色譜圖來(lái)驗(yàn)證本色譜法的可靠性和準(zhǔn)確性。

1.7.1 標(biāo)品制備 于10 mL離心管中分別加入適量的蘭索拉唑貯備液，使之成為濃度為 100，500，1 000 ng·mL-1的溶液，再加適量30%乙腈溶液，使總體積為300μL，混勻，離心，取上清液進(jìn)樣分析。

1.7.2 樣品制備 取空白血漿1 mL置于10 mL離心管中，分別加入蘭索拉唑貯備液使之濃度為100，500，1 000 ng·mL-1，其余步驟按“1.6”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析。取患者服藥2 h之后的血漿按“1.6”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理 兩種制劑主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)血藥峰濃度(Cmax)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，采用雙單側(cè)檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)，達(dá)峰時(shí)間(tmax)采用Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測(cè)限 于空白血漿1 mL中分別加入適量蘭索拉唑貯備液，使其濃度分別為50，100，200，400，800，1 600，2 400 ng·mL-1的蘭索拉唑溶液，加入內(nèi)標(biāo)液20μL，其余步驟按“1.6”項(xiàng)下處理方法進(jìn)行色譜分析。由圖1可見(jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，色譜峰峰型好。血漿中的雜質(zhì)不干擾測(cè)定，方法具有較強(qiáng)的專屬性。其中蘭索拉唑的保留時(shí)間為15.8 min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為7.6 min。以藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)，以所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:Y=0.000 755X-0.011 320，r=0.999 2。該結(jié)果表明蘭索拉唑在50～2 400 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。本測(cè)定方法的最低定量下限為50 ng·mL-1。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿1.0 mL，分別加入適量蘭索拉唑貯備液，使成為濃度 100，500，1 000 ng·mL-1的蘭索拉唑溶液得血漿樣品各數(shù)份，按前述血漿樣品處理方法，于1 d內(nèi)測(cè)定，得日內(nèi)精密度RSD分別為3.7%，0.4%，0.6% 。于不同日反復(fù)測(cè)定，得日間精密度RSD分別為4.4%，2.9%，1.2% 。

圖1 3種血漿的HPLC色譜圖A.空白血漿;B.空白血漿加對(duì)照品及內(nèi)標(biāo);C.服用蘭索拉唑片2 h后血漿;1.奧美拉唑;2.蘭索拉唑Fig．1 HPLC chromatograms of 3 kinds of plasmas sam p lesA.blank plasma;B.blank plasma spiked with reference substance and internal standard;C.plasma sample at 2 h after administration of lansoprazole;1.omeprazole;2.lansoprazole

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 蘭索拉唑血漿樣品分別在室溫放置6，8，12，24 h 及2，3 d，反復(fù)凍融后操作，保持穩(wěn)定，含量保留百分?jǐn)?shù)平均值為93.47%。本實(shí)驗(yàn)在血漿測(cè)定過(guò)程中，于每日平行測(cè)定低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品，其測(cè)得值在真實(shí)值的±10%范圍內(nèi)。

2.4 介質(zhì)效應(yīng) 由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)建立的色譜分析法能有效保證樣品與內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物的完全分離，適用于蘭索拉唑的藥動(dòng)學(xué)研究和臨床用藥監(jiān)測(cè)。

2.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 對(duì)數(shù)據(jù)的處理結(jié)果表明，20例健康志愿者服用受試制劑后血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(concentration-time area under the curves，AUC)的 90%可信限落在參比制劑80.0% ～125.0%范圍內(nèi)，Cmax的90%可信限落在參比制劑70.0%～143.0%范圍內(nèi)，tmax經(jīng)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試制劑與參比制劑各主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，受試制劑對(duì)參比制劑的生物利用度為(95.6±32.8)%，在人體內(nèi)具有生物等效性。志愿者服用兩種制劑后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖見(jiàn)圖2，主要參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 健康受試者口服蘭索拉唑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab．1 The pharmacokinetic parameters of the healthy volunteers after oral adm inistration w ith lansoprazole tablets±s

表1 健康受試者口服蘭索拉唑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab．1 The pharmacokinetic parameters of the healthy volunteers after oral adm inistration w ith lansoprazole tablets±s

制劑 例數(shù)C max/(ng·mL-1)t max/h AUC0-12 h/(μg·h·mL-1)AUC0-∞/(μg·h·mL-1)t1/2/h受試制劑 20 854.82±249.70 2.82±0.69 3 779.90±1 191.52 4 078.54±1 171.17 2.38±0.48參比制劑 20 813.22±289.59 2.52±0.80 3 513.00± 742.25 3 742.64± 749.85 2.19±0.49

3 討論

3.1 色譜條件 目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)本藥血漿濃度的測(cè)定方法較多，有電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法［6］，不常用;也曾嘗試過(guò)用熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射法，但效果不好，經(jīng)摸索選定了紫外檢測(cè)法。流動(dòng)相嘗試過(guò)甲醇∶水，甲醇∶乙腈，甲醇∶碳酸鹽緩沖液，經(jīng)比較表明甲醇∶乙腈(30∶70)分離效果較好，在加入1‰三乙胺溶液之后，峰型明顯改善。嘗試酸性條件下pH=2.0分離效果并不好，而在pH=7.00±0.02、柱溫為40℃時(shí)效果最好。內(nèi)標(biāo)曾選擇對(duì)羥基苯甲酸乙酯、泮托拉唑等［7］，后證實(shí)用奧美拉唑作為內(nèi)標(biāo)，能呈現(xiàn)較好的分離效果，出峰時(shí)間合適。

3.2 樣品處理方法 蘭索拉唑見(jiàn)光易分解，需避光保存樣品溶液，且保存在-4℃冰箱中。提取樣品時(shí)，筆者參考過(guò)不同的溶劑提取方法，有乙醚-二氯甲烷［8］、二氯甲烷-乙酸乙酯［9］，操作過(guò)程較繁瑣，提取率較低，雜質(zhì)較多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明乙酸乙酯分離提取的效果最佳。乙酸乙酯單次提取與多次提取實(shí)驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

［1］ MIROSHNICHENKO I I，YURCHENKO N I.HPLC analysis for omeprazole and lansoprazole in blood plasma［J］.Pharm Chem J，2002，36(7):48-50.

［2］ 李茜，鄧俊剛，喬建，等.蘭索拉唑片相對(duì)生物利用度與生物等效性研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(2):165-167.

［3］ BARRADELL L B，F(xiàn)AULDS D，MCTAVISH D，et al.Lansoprazole，a review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and its therapeutic efficacy in acid-related disorders［J］.Drugs，1992，44(2):225-227.

［4］ ROBIN E P，RODRIGUES A D，JOYCE A，et al.Identification of the human P450enzymes involved in lansoprazole metabolism［J］.JPharm Expe Ther ，1996，277(7):805-810.

［5］ LINDBER G P，BRANDSTROM A，WALLMARK B，et al.Omeprazole:the first proton pump inhibitor［J］.Med Res Rev，1990，10(1):1-3.

［6］ CELSO H O，RAFAEL E B，EDUARDO A，et al.Lansoprazole quantification in human plasma by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry［J］.JChromatogra B，2003，78(3):453-455.

［7］ 李毅敏，陳麗字，馬麗鵑，等.蘭索拉唑血藥濃度的高效液相色譜(HPLC)測(cè)定［J］.藥物分析雜志，1996，16(4):252-253.

［8］ 胡靈，官常榮，崔曉宇，等.反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中的蘭索拉唑濃度［J］.藥物分析雜志，2007，27(3):325-326.

［9］ 曾曉暉，石磊，羅新根，等.反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中蘭索拉唑的濃度［J］.中國(guó)藥師，2006，9(9):823-824.