沒(méi)食子中沒(méi)食子鞣質(zhì)的提取工藝及免疫作用研究*

范曉紅，李治建，斯拉甫·艾白，3，劉發(fā)，周露，孟繁龍

(1.新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院，832000;2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049;3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830049)

沒(méi)食子(Turkish galls)為殼斗科植物沒(méi)食子樹(shù)(Quercus infectoria oliv.)幼樹(shù)上的蟲(chóng)癭，由沒(méi)食子蜂(Cynips gallae-tinctoriae oliv.)寄生而形成。藥材主要藥用成分為沒(méi)食子鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸等活性成分。沒(méi)食子中富含沒(méi)食子鞣質(zhì)，沒(méi)食子鞣質(zhì)具有多方面藥理活性，具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用［1-3］。沒(méi)食子鞣質(zhì)極不穩(wěn)定，容易在酸、堿、酶的催化作用下水解，不同溶劑和不同提取方法直接影響沒(méi)食子鞣質(zhì)的藥效。筆者對(duì)沒(méi)食子鞣質(zhì)的提取分離進(jìn)行了初步優(yōu)選，以沒(méi)食子酸提取率為指標(biāo)，建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的高效液相色譜(HPLC)法含進(jìn)行量測(cè)定。通過(guò)比較不同方法提取沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響的研究，分析沒(méi)食子鞣質(zhì)的最佳提取工藝，為沒(méi)食子的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀:Waters1525二元泵高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測(cè)器，Empower數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(美國(guó));Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);MCO-175二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱;XD-101倒置顯微鏡;550-BIORAD酶標(biāo)儀(美國(guó))。

1.2 試藥 沒(méi)食子藥材品種由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定;沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110831-200803);甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 沒(méi)食子鞣質(zhì)提取工藝研究

2.1.1 水和80%丙酮浸泡提取 取過(guò)孔徑250μm(4號(hào))篩沒(méi)食子藥材粉末兩份，每份50 g，加水和80%丙酮室溫浸泡提取3次，水提取每次30 min，丙酮提取每次浸泡2 d。提取液合并減壓濃縮，真空干燥后，加適量水混懸，用乙醚提取，水層部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，真空干燥，干燥溫度不超過(guò)50 ℃［4-5］。

2.1.2 甲醇超聲提取 沒(méi)食子粉末(過(guò)孔徑250μm篩)50 g經(jīng)70%甲醇超聲處理1 h，室溫避光浸泡24 h，提取3次。合并濾液，減壓濃縮，真空干燥得浸膏，加適量水混懸，用乙醚提取，水層部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，得浸膏［6］。

2.1.3 乙醇攪拌提取 取干燥的沒(méi)食子粉末(過(guò)孔徑250μm篩)50 g，置棕色瓶中，經(jīng)50%乙醇室溫?cái)嚢杼崛? h，提取3次，減壓濃縮，回收乙醇。真空干燥后加適量水混懸，用乙醚提取，水層部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，得浸膏［7］。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動(dòng)相:A相:0.2%磷酸(H3PO4)溶液;B相:甲醇(CH3OH)，A∶B=90∶10，柱溫:30℃檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品25.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度(每毫升中含沒(méi)食子酸0.50 mg)。

2.2.3 供試品溶液的制備 取精密稱取原藥材粉末(過(guò)孔徑250μm篩)、甲醇提取物、丙酮提取物、水提取物、乙醇提取物各0.5 g，加入4 mol·L-1鹽酸溶液50 mL，水浴中加熱，水解3.5 h，定容至100 mL(原藥材要經(jīng)過(guò)濾之后定容)，后精密稱取2 mL，置250 mL棕色量瓶中，加水至刻度，搖勻即得樣品溶液［8］。

2.2.4 樣品含量測(cè)定 樣品溶液和對(duì)照品溶液分別用孔徑0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后，分別進(jìn)樣10μL，注人色譜柱，按上述色譜條件測(cè)定。以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各樣品中沒(méi)食子酸的含量。

2.2.5 線性關(guān)系的考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置25mL 棕色量瓶中，用孔徑0.45μm濾膜濾過(guò)，進(jìn)針上樣。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=28 574X-51 114，r=0.999 7，沒(méi)食子酸在 10.32 ～103.20μg線性關(guān)系良好。

2.2.6 方法學(xué)考察 精密度實(shí)驗(yàn):在“2.2.1”項(xiàng)條件下，精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD=1.8%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密稱取干燥沒(méi)食子，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定沒(méi)食子酸的含量，RSD=1.6%(n=6)，證明此方法精密度良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取室溫下放置的樣品溶液，在15 h內(nèi)進(jìn)樣6次，其峰面積的RSD=1.9%，表明樣品溶液在室溫下15 h穩(wěn)定。

加樣回收率實(shí)驗(yàn):取已知含量的樣品5份，每份約20 mg，分別精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(濃度為0.05 mg·mL-1)10 mL，超純水溶解定容至25 mL棕色量瓶中即得。分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定，計(jì)算平均回收率為101.76%，RSD為1.9%(n=5)。

2.3 不同提取方法提取沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠免疫功能的作用

2.3.1 對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 脾細(xì)胞懸液制備［9］:在無(wú)菌條件下取小鼠脾臟，用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，然后放在細(xì)胞過(guò)濾篩上，用塑料注射器芯研碎脾臟，培養(yǎng)液沖洗獲取單細(xì)胞懸液。制備好后用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為(1～5)×106個(gè)·mL-1。

淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［10］:將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，再在各孔中加入不同濃度藥物100μL，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，對(duì)照組加培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66 h后，取出，根據(jù)噻唑藍(lán)比色法測(cè)定生存細(xì)胞活性，在培養(yǎng)結(jié)束前4～6 h，向每孔中加入5 mg·mL-1噻唑藍(lán)溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h，離心(1 000 r·min-1，r=15 cm，10min)后，輕輕吸棄上清液，加入二甲亞砜溶液100μL，稍震蕩，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度(A)值。

對(duì)刀豆蛋白(concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng):將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，再在各孔中加入100μL不同濃度藥物，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，最后加Con A溶液20μL，溶劑對(duì)照組為培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66 h后，取出，根據(jù)噻唑藍(lán)比色法測(cè)定存活細(xì)胞活性。

2.3.2 沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備參照文獻(xiàn)［10］，制備好的細(xì)胞用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至3×106個(gè)·mL-1。再以每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。棄上清液，用培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)孔內(nèi)為腹腔巨噬細(xì)胞。每孔加培養(yǎng)液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)。按下列分組加樣，空白對(duì)照組加培養(yǎng)液100μL，加藥組加100μL(終質(zhì)量濃度為100，50，25 μg·mL-1)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，棄上清液，加 0.075%中性紅溶液，每孔 100μL，培養(yǎng)30 min后，以磷酸鹽緩沖溶液洗3次，加醋酸-乙醇(1∶1)細(xì)胞溶解液，每孔100μL，于4℃靜置過(guò)夜，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)A值。

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法對(duì)沒(méi)食子鞣質(zhì)提取效果的影響用HPLC方法測(cè)定提取物中沒(méi)食子酸提取率，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，70%甲醇超聲提取沒(méi)食子酸提取率最高，對(duì)沒(méi)食子鞣質(zhì)的提取效果最佳。

表1 不同提取方法樣品沒(méi)食子酸含量測(cè)定和提取率結(jié)果Tab．1 The content determ ination and extraction rate of gallic acids in samples by different technology%± s，n=3

表1 不同提取方法樣品沒(méi)食子酸含量測(cè)定和提取率結(jié)果Tab．1 The content determ ination and extraction rate of gallic acids in samples by different technology%± s，n=3

提取方法 溶劑 水解后沒(méi)食子酸含量沒(méi)食子酸提取率浸泡 水22.23±1.77 62.24±2.12浸泡 80%丙酮 21.82±1.93 61.43±2.65超聲 70%甲醇 27.32±2.05 77.01±2.97攪拌 50%乙醇23.76±2.10 66.95±2.17

原藥材水解后沒(méi)食子酸平均含量為35.47%，沒(méi)食子酸的提取率(%)=提取出的沒(méi)食子酸含量/藥材水解后沒(méi)食子酸的含量×100%。

3.2 不同提取方法提取沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的作用

3.2.1 對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)表2。可知，沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化A差值均大于空白對(duì)照組，水浸泡提取物、甲醇超聲提取物和乙醇攪拌提取物經(jīng)萃取得到的沒(méi)食子鞣質(zhì)濃度為20μg·mL-1時(shí)均能不同程度地增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，丙酮浸泡提取物萃取得到的沒(méi)食子鞣質(zhì)濃度在40μg·mL-1增強(qiáng)了小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。

3.2.2 對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表3。可知，沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，4種提取物濃度在所試范圍內(nèi)均能不同程度地增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，乙醇攪拌提取物和丙酮浸泡提取物萃取得到的沒(méi)食子鞣質(zhì)濃度在40μg·mL-1就能明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。

3.2.3 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)不同提取方法提取沒(méi)食子鞣質(zhì)在4.7～18.8μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均能明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，但吞噬細(xì)胞的吞噬功能各組間差異均不顯著。

4 討論

沒(méi)食子有效成分主要是鞣質(zhì)類的成分，沒(méi)食子鞣質(zhì)是復(fù)雜多元酚類的混合物，相對(duì)分子質(zhì)量較大，極性強(qiáng)，性質(zhì)較為活潑，在提純過(guò)程中，容易發(fā)生氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)。鞣質(zhì)通常用極性溶劑進(jìn)行提取，為了減少雜質(zhì)，多采用不加熱的提取方法。筆者采用該法測(cè)定總鞣質(zhì)的含量，與經(jīng)典的鞣質(zhì)含量測(cè)定方法相比，HPLC法為鞣質(zhì)定量分析開(kāi)辟新的前景，鞣質(zhì)在酸性條件下水解為沒(méi)食子酸，以沒(méi)食子酸含量為指標(biāo)檢測(cè)鞣質(zhì)含量，結(jié)果準(zhǔn)確有效、重復(fù)性好。

表2 不同工藝沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響(A值)Tab．2 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation(A)±s

表2 不同工藝沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響(A值)Tab．2 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation(A)±s

與對(duì)照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取沒(méi)食子鞣質(zhì)組 20 0.329 ±0.037*1 0.276±0.025*1 0.246±0.020 0.310 ±0.030*1 40 0.337 ±0.034*1 0.348±0.034*1 0.321±0.062*1 0.337 ±0.034*1 80 0.397 ±0.061*2 0.341±0.040*2 0.370±0.037*2 0.352 ±0.039*2對(duì)照組 0 0.275±0.028 0.223±0.021 0.240±0.016 0.205±0.038

表3 不同工藝沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響(A值)Tab．3 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation induced by ConA(A)±s

表3 不同工藝沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響(A值)Tab．3 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation induced by ConA(A)±s

與對(duì)照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取沒(méi)食子鞣質(zhì)組 20 0.283±0.027 0.235±0.020 0.216±0.032 0.266±0.051 40 0.291±0.030 0.242±0.044 0.276±0.042*1 0.297 ±0.030*1 80 0.317±0.039*2 0.283±0.022*2 0.316 ±0.031*2 0.349 ±0.038*2對(duì)照組 0 0.258±0.041 0.223±0.022 0.219±0.030 0.248±0.033

表4 不同工藝沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(A值)Tab．4 Effects of gallotannins extracted by different technology on phagocytosis ofmouse peritonealmacrophages(A)±s

表4 不同工藝沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(A值)Tab．4 Effects of gallotannins extracted by different technology on phagocytosis ofmouse peritonealmacrophages(A)±s

與對(duì)照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取沒(méi)食子鞣質(zhì)組 4.7 0.158±0.023 0.163±0.034 0.133±0.029 0.137±0.032 9.4 0.184±0.034*1 0.193±0.034*1 0.137±0.024 0.203±0.052*1 18.8 0.226±0.041*2 0.232±0.012*2 0.172±0.025*2 0.220±0.017*2對(duì)照組 0.0 0.133±0.011 0.136±0.013 0.102±0.030 0.147±0.011

免疫增強(qiáng)藥物可能在機(jī)體免疫過(guò)程的不同環(huán)節(jié)起作用，文獻(xiàn)報(bào)道沒(méi)食子鞣質(zhì)類可以增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。篩選研究影響免疫功能的藥物時(shí)，影響免疫功能的研究方法較為復(fù)雜，近年來(lái)進(jìn)展也較快。筆者采用體外方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，沒(méi)食子鞣質(zhì)有協(xié)同ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖作用。實(shí)驗(yàn)表明沒(méi)食子鞣質(zhì)也能促進(jìn)無(wú)絲裂原刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖，說(shuō)明沒(méi)食子鞣質(zhì)本身就可以啟動(dòng)淋巴細(xì)胞表面受體活化，具有絲裂原的刺激作用。該方法雖然不能反映淋巴細(xì)胞的全部功能，但可代表影響淋巴細(xì)胞活化的事實(shí)。以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在體外吞噬中性紅為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)不同提取方法提取沒(méi)食子鞣質(zhì)可使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯增加。本研究提示，沒(méi)食子鞣質(zhì)能顯著增強(qiáng)小鼠特異性免疫和非特異性免疫功能，但能否全面增強(qiáng)機(jī)體免疫功能還有待進(jìn)一步研究。

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