自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療缺血性下肢血管病變患者254例

許憶峰 楊曉鳳 吳雁翔 王紅梅 張軼斌 呂乃武 單鴻 崔激平 周金旭

缺血性下肢血管病變主要包括糖尿病足（diabetic foot,DF）、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（atherosclerosis occlusion,ASO）、血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis,TAO）等，其表現(xiàn)為間歇性跛行、下肢的靜息痛、潰瘍及壞疽等，嚴(yán)重時(shí)需截肢甚至威脅生命，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。由于其高危因素如老齡、糖尿病、吸煙、高血壓和肥胖等因素的持續(xù)存在，該發(fā)病率有持續(xù)上升趨勢(shì)。由于血管閉塞的情況復(fù)雜，單一的血管搭橋、支架、血管擴(kuò)張和超聲消融等治療方法效果不甚理想。近年來干細(xì)胞療法在缺血性下肢血管病變治療中的應(yīng)用越來越多，為難治性的下肢血管病變帶來了新的希望[1]。我們對(duì)254例患有缺血性下肢血管病變的患者進(jìn)行了自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療，進(jìn)行了為期1年的自身前后對(duì)照研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

一、一般資料

2003年11月至2008年8月期間，254例患者入組，年齡18～90歲，平均(56.8±15.8)歲，男167例，女87例。經(jīng)臨床癥狀、體征、下肢血管彩超、CT血管造影（computed tomographic angiography,CTA）及動(dòng)脈造影檢查等確診為缺血性下肢血管病變，其中DF 96例(37.8﹪)，ASO 86例(33.9﹪)，脈管炎72例(28.3﹪)，按足部病變Fontaine 分級(jí)Ⅱ期38例，Ⅲ期190例，Ⅳ期26例，合并冠心病72例，高血壓54例，血脂異常92例，腦梗死26例?；颊呔嬖诓煌潭鹊拈g歇性跛行、下肢疼痛和難以愈合的缺血性潰瘍等。

患者均接受常規(guī)藥物治療無(wú)效，且不適合行介入和搭橋手術(shù)，無(wú)嚴(yán)重心肝腎功能不全，無(wú)過敏體質(zhì)、腫瘤史，無(wú)嚴(yán)重急性感染，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

所有患者均接受抗血小板治療（如阿司匹林），部分患者接受鈣離子拮抗劑等降壓藥、他汀類調(diào)脂藥、胰島素或口服降糖藥物治療，疼痛劇烈的患者予用二、三階梯類止痛藥物（如曲馬多、羥考酮等），同時(shí)潰瘍患者接受常規(guī)清創(chuàng)、減壓、換藥治療，有感染患者根據(jù)藥敏使用廣譜抗生素治療穩(wěn)定感染，移植術(shù)前后的常規(guī)治療基本保持不變。

二、病情的評(píng)估

觀察移植術(shù)前后足部疼痛感覺、冷感、深感覺和間歇性跛行距離， 觀察潰瘍和壞疽情況。移植術(shù)前后用多功能紅外線體溫儀(瑞士Infraeye PICCOLO公司)檢測(cè)足部皮溫，深感覺測(cè)定儀(美國(guó)Bio-siometer公司)測(cè)定足部深感覺，多普勒血流探測(cè)儀（日本ES-1000SPM林電器株式會(huì)社）檢測(cè)踝肱比，雷度多導(dǎo)聯(lián)經(jīng)皮氧分壓測(cè)定儀(丹麥TCMTM400公司)測(cè)定足部經(jīng)皮氧分壓。病情進(jìn)行Fontaine分期。所有檢測(cè)均在室溫（25.0±1.0）℃和濕度（50.0±20.0）﹪條件下進(jìn)行，患者靜息至少15min后測(cè)定。所有的指標(biāo)于術(shù)前及術(shù)后3、6和12個(gè)月時(shí)重復(fù)測(cè)定。隨訪中嚴(yán)密觀察是否有不良反應(yīng)。

肢體感覺分級(jí)：（1）肢體疼痛分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)疼痛；1級(jí)：偶有疼痛；2級(jí)，經(jīng)常疼痛，不需或偶用一般止痛劑；3級(jí)，經(jīng)常疼痛，需經(jīng)常用一般止痛劑；4級(jí)，疼痛影響睡眠，一般止痛劑難以緩解，需用麻醉性鎮(zhèn)痛藥。本組下肢疼痛情況：0級(jí)8例；1級(jí)33例；2級(jí)79例；3級(jí)88例；4級(jí)46例。（2）肢體冷感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)冷感；1級(jí)，偶有受累肢體發(fā)涼、怕冷感；2級(jí)，常有受累肢體發(fā)涼、怕冷感；3級(jí)，受累肢體有明顯冷、涼感，需要采用局部保溫措施，癥狀才能得到一定程度的緩解；4級(jí)，受累肢體有明顯的冷、涼感，采用局部保溫措施癥狀也無(wú)明顯改善。本組患者患肢均有不同程度的冷感，2級(jí)78例；3級(jí)99例；4級(jí)77例。（3）肢體跛行分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：按正常速度(60～70 m/min)行走。0 級(jí)，行走≥500 m，無(wú)疼痛；1級(jí)，行走400～499 m，有疼痛；2級(jí)，行走300～399 m，有疼痛；3級(jí)，行走100～299 m，有疼痛；4級(jí)，靜息痛，無(wú)法行走，或僅行走< 100 m，即有疼痛。本組0級(jí)22例，1級(jí)44例，2級(jí)62例，3級(jí)80例，4級(jí)46例。（4）潰瘍壞疽情況：本組合并潰瘍61例，壞疽26例。

三、自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞的采集和治療方法

全部患者均使用rhG-CSF(吉粒芬，杭州九源藥業(yè)公司)5 mg·kg-1·d-1術(shù)前皮下注射共2 d，進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞動(dòng)員。監(jiān)測(cè)外周血常規(guī)值，干細(xì)胞動(dòng)員第3天白細(xì)胞總數(shù)達(dá)（15.2～32.6）×109/L[平均（21.1±7.8）×109/L]。第3天行骨髓采集術(shù)，局部麻醉下從髂后上嵴抽取骨髓200ml，去除紅細(xì)胞，密度梯度離心，分離出單個(gè)核細(xì)胞，再將收獲的單個(gè)核細(xì)胞制成50ml左右的細(xì)胞懸液備用。計(jì)數(shù)細(xì)胞總量并測(cè)定CD34+及CD133+細(xì)胞含量（流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司）。單次移植提取的單個(gè)核細(xì)胞總量平均為 ( 5.16±2.47)×108，其中 CD34+細(xì)胞含量為 (4.24±2.16)﹪，CD133+細(xì)胞含量為( 1.89±1.52)﹪。在手術(shù)室進(jìn)行細(xì)胞移植術(shù)，將采集的單個(gè)核細(xì)胞配制成濃度為2.16×1010/L的細(xì)胞混懸液，依大血管走行，足部按1 cm×1 cm 間距行肌肉注射，小腿部位按3 cm×3 cm 間距，肌肉注射。

四、隨訪指標(biāo)

所有患者均隨訪12個(gè)月。治療前及治療后3、6和12個(gè)月分別進(jìn)行以下指標(biāo)觀察：（1）疼痛、冷感和跛行距離，觀察潰瘍和壞疽情況。（2）皮溫、深感覺、經(jīng)皮氧分壓和踝肱比。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用表示，皮溫等指標(biāo)的組間比較采用F檢驗(yàn)，與基線組比較采用LSD檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者癥狀及體征變化(表1、表2)

（1）疼痛情況：疼痛消失18例(Ⅱ期18例)， 緩解139例(Ⅱ期17例，Ⅲ期112例，Ⅳ期10例)，無(wú)緩解97例(Ⅱ期3例，Ⅲ期78例，Ⅳ期16例)。緩解率61﹪(157 /254 )。（2）冷感情況：冷感緩解188例(Ⅱ期29例，Ⅲ期144例，Ⅳ期15例)，無(wú)緩解66例。緩解率74﹪(188 /254 )。（3）跛行情況：跛行延長(zhǎng)102例(Ⅱ期23例，Ⅲ期72例，Ⅳ期7例)。好轉(zhuǎn)率40﹪(102 /254 )。（4）潰瘍情況：愈合18例，縮小18例，無(wú)變化15例，擴(kuò)大10例。好轉(zhuǎn)率59.0﹪(36 /61)。(5)壞疽情況：截肢6例，脫落愈合5例，無(wú)變化8例，擴(kuò)大7例(圖1、2)。

表1 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者術(shù)后病情變化（例）

表2 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者手術(shù)前后病情變化分級(jí)（例）

圖1 缺血性下肢血管病變致右足潰瘍患者干細(xì)胞治療前后對(duì)比（一）

圖2 缺血性下肢血管病變致右足潰瘍患者干細(xì)胞治療前后對(duì)比（二）

二、患者客觀檢查指標(biāo)變化

患者移植部位的皮溫、經(jīng)皮氧分壓及踝肱比均有升高(t=13.32，t=5.157，t=8.104)， 深感覺閾值降低（t=4.901）， P值均< 0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者治療后皮溫、深感覺、踝肱比及經(jīng)皮氧分壓值（）

表3 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者治療后皮溫、深感覺、踝肱比及經(jīng)皮氧分壓值（）

注：a與基線值相比 P < 0.05

移植后時(shí)間 皮溫(℃) 深感覺(mV) 踝肱比 經(jīng)皮氧分壓(mm Hg)基線值 32.89±2.19 26.20±15.70 0.62±0.36 26.46±18.401周后 32.86±2.66 26.30±15.60 0.63±0.36 26.51±18.403個(gè)月后 34.05±1.76a 23.17±13.50a 0.72±0.30a 29.47±16.58a 6個(gè)月后 34.86±1.67a 21.59±12.00a 0.79±0.26a 31.80±15.60a 12個(gè)月后 35.52±2.26a 20.34±10.80a 0.84±0.24a 34.14±14.99a

三、不良事件

所有患者治療后1～3 d 局部注射處有不同程度的脹痛， 無(wú)其他異常癥狀體征出現(xiàn)，心電圖和肝腎功能無(wú)特殊改變。

討 論

缺血性下肢血管病變是一種危害健康、降低患者生活質(zhì)量、致殘率較高的疾病，傳統(tǒng)的藥物、血管搭橋、介入手術(shù)和截肢術(shù)等治療方法均有局限性。干細(xì)胞技術(shù)是近年出現(xiàn)的一項(xiàng)新方法，發(fā)展迅速并已有許多臨床研究。根據(jù)發(fā)育階段的不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞，成體干細(xì)胞根據(jù)其來源可分為骨髓干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞及臍帶干細(xì)胞等，根據(jù)干細(xì)胞分化組織不同還可分為造血干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞，干細(xì)胞技術(shù)臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)是干細(xì)胞具有分化潛能，可分化成各種機(jī)體組織細(xì)胞，包括成血管細(xì)胞和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）[2]，并進(jìn)一步分化形成新生毛細(xì)血管[3]。

對(duì)于骨髓干細(xì)胞的研究目前相對(duì)較多，研究證實(shí)骨髓細(xì)胞可分泌諸如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素1β等促進(jìn)血管生成因子[4-5]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)缺血肢體行骨髓干細(xì)胞移植后，有新的血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管形成[6]。自體干細(xì)胞移植治療缺血性下肢血管病變即利用此原理，將干細(xì)胞移植至缺血足部，使其分化形成新生毛細(xì)血管，改善并恢復(fù)局部血流。Tateishi-Yuyama等[7]最早使用骨髓單個(gè)核細(xì)胞(含內(nèi)皮祖細(xì)胞)注射治療因周圍血管病導(dǎo)致的下肢缺血，治療4周后，患者踝肱指數(shù)明顯提高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的骨髓單核干細(xì)胞移植到小鼠皮膚創(chuàng)傷處，局部環(huán)境可刺激干細(xì)胞移入，并分化為皮膚各種細(xì)胞和結(jié)構(gòu)，表明骨髓單核干細(xì)胞移植可修復(fù)皮膚潰瘍[8]。且骨髓單核干細(xì)胞也可通過釋放促血管形成因子，促進(jìn)潰瘍愈合。2003年谷涌泉等[9]在國(guó)內(nèi)首先開展了自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療下肢缺血的臨床研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者達(dá)到了避免截肢或降低截肢平面的目的。其后來的臨床應(yīng)用研究認(rèn)為，自體骨髓單核干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病具有一定的療效，而且療效與移植干細(xì)胞總量有密切關(guān)系[10]。楊曉鳳等[11]認(rèn)為經(jīng)動(dòng)員后采用血細(xì)胞分離機(jī)采集的外周血單核干細(xì)胞，CD34+、CD133+細(xì)胞總數(shù)明顯高于BMSCs，疼痛和冷感改善較BMSCs迅速，但干細(xì)胞移植前后臨床癥狀及檢查指標(biāo)兩組未見明顯差異，且進(jìn)行血細(xì)胞單采及大劑量骨髓動(dòng)員劑對(duì)患者的身體狀態(tài)要求相對(duì)較高，高齡及并發(fā)癥較多的患者風(fēng)險(xiǎn)較大，骨髓采集則相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)略小。李學(xué)峰等[12]對(duì)于血栓閉塞性脈管炎采用自體骨髓干細(xì)胞移植治療，取得良好效果；很多臨床研究都有力的支持了骨髓干細(xì)胞治療缺血性下肢血管病變的療效及安全性[13-14]。另外骨髓動(dòng)員劑G-CSF刺激骨髓生成，使骨髓干細(xì)胞釋放至外周血中EPC 數(shù)量增加[15]，趨化到缺血局部的EPC 相應(yīng)增加[16]；可能亦會(huì)促進(jìn)缺血局部的血管生成。本組觀察發(fā)現(xiàn)移植后患者疼痛、冷感明顯緩解，跛行距離延長(zhǎng)，潰瘍愈合或減小，足部和下肢皮溫、踝肱比及經(jīng)皮氧分壓均升高，深感覺改善。因此我們認(rèn)為自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植是一種有效治療下肢缺血性血管病的方法，尤其對(duì)非終末期患者改善癥狀明顯，可促進(jìn)潰瘍愈合，無(wú)排斥反應(yīng)，無(wú)明顯副作用及并發(fā)癥。

對(duì)于自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植現(xiàn)在仍有許多問題有待進(jìn)一步明確：（1）移植細(xì)胞的數(shù)量、種類、移植途徑與療效的關(guān)系；（2）移植干細(xì)胞的質(zhì)量檢測(cè)、動(dòng)員多長(zhǎng)時(shí)間為最適當(dāng)；（3）如何分離較純的CD34+細(xì)胞及體外增殖干細(xì)胞；（4）骨髓刺激后干細(xì)胞亞群如何變化，細(xì)胞因子在其中發(fā)揮何種作用，對(duì)缺血局部炎癥反應(yīng)及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有何影響；（5）是否會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)期并發(fā)癥以及有沒有致腫瘤的可能等。對(duì)以上問題的進(jìn)一步研究有助于探討自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植改善下肢缺血的機(jī)制，為進(jìn)一步提高自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療下肢缺血的療效提供理論基礎(chǔ)。而隨著研究的深入，相信這些問題會(huì)逐漸得到解決。

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