多胚亞麻的胚珠整體透明與解剖觀察

康慶華 ，徐 涵 ，關鳳芝 ，吳廣文 ，孫中義 ，黃文功 ，程莉莉 ，姜衛(wèi)東 ，趙東升 ，劉 巖 ，吳建忠 ，宋喜霞 ，余 瑩

（1.黑龍江省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所哈爾濱150086；2.法國圖盧茲綜合科學研究所（IRIT-ARI）法國，圖盧茲31300；3.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧研究所哈爾濱150086）

栽培種亞麻（Linum usitatissimum L.），簡稱亞麻，屬亞麻科、亞麻屬（Linum）[1]，該種內極少部分種質存在多胚性，即在一個胚珠內存在兩個或兩個以上胚胎。在多胚中，附加胚大多由植物無融合生殖產(chǎn)生，從多胚苗中可能篩選獲得單倍體，所以多胚亞麻的利用成為當今亞麻育種的一個新方向。多胚亞麻的胚胎學研究是多胚種質利用的基礎，但至今其細胞學機制未能明確。因此進行亞麻多胚胚胎發(fā)生及發(fā)生方式的研究是十分必要的。

植物幼胚被多層胚珠組織包裹，通常采用切片、人工分離(酶法或手工分離)、整體-透明等方法觀察。其中整體透明技術是觀察植物幼胚最快捷、最簡單的方法。植物胚珠的整體透明技術最初由Herr(1971)提出，但Herr的方法需要使用相差和干涉顯微鏡[2]。在此基礎上，Crane(1978)使用冬青油(水楊酸甲酯，methyl salicylate)作為透明劑對整體透明技術進行了改進，用于觀察整體胚珠中的胚囊，效果良好[3]。后來，楊弘遠使用愛氏蘇木精(Ehrlich’s hematoxylin)染色-冬青油透明技術進一步完善了整體染色與透明技術[4][5][6]，但該技術制片時間長（至少需要2 d）而且所使用的透明劑冬青油具有毒性[7]。由于本試驗所要進行的是在大量胚珠篩選多胚并對雙胚的發(fā)生及發(fā)生方式進行觀察，需要達到量化的、3D數(shù)據(jù)采集目的，所以進行了改進，獲得了快速、低毒、易于解剖和觀察的較好效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的亞麻幼嫩果序于2010年7月上旬采自黑龍江省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所哈爾濱市試驗區(qū)。該試驗材料組合號H04052，為多胚誘導雜交組合的后代。采集后直接用于試驗。

1.2 試驗方法

固定：果序取回后，在卡諾固定液常溫固定24小時后放于75%的酒精中保存。

水合：用50%、25%、0%的酒精溶液沖洗。

解離：從果序上摘下蒴果，分三類：受精1～3d的為一類，放入同一三角瓶內，受精4～6d的為一類，受精7d以上的為一類。加入1M氫氧化鈉溶液60°C下處理10～30min。冷卻后用清水沖洗。

透明：剖開蒴果取出受精后的胚珠放入10%次氯酸鈉溶液中浸透（真空）2h。

解剖觀察：取已透明的胚珠用水沖洗后，放在培養(yǎng)皿或載玻片上，在Leica倒置熒光顯微鏡下觀察、解剖并顯微攝像。

2 結果與分析

2.1 亞麻的子房結構觀察

將亞麻受精后的子房剖開后，可見5個子房室(幼嫩果室)，每個子房室內有2個胚珠。一般1個胚珠發(fā)育成1個正常的幼嫩種子。

2.2 亞麻受精胚珠的透明效果

已透明的胚珠用清水沖洗后，胚珠內的幼胚輪廓已明顯可見(圖1～3)。

2.3 胚珠內幼胚的觀察與解剖

壓片后在顯微鏡下可觀察到的幼胚。受精4～6d的胚珠透明效果最好，容易完整解剖出幼胚(圖4～6)。

2.4 多胚發(fā)生率

整體解剖50個胚珠，其中有20個沒有胚胎（原因可能是授粉不良所致）；26個具有正常的單個合子胚；4個具有雙胚。雙胚發(fā)生率為8%。

2.5 多胚排列方式

所觀察到的4個多胚胚珠都是雙胚（圖7～9），胚胎在胚乳中生長。其中，有1個著生位置不能確定，1對雙胚疑似2個胚縱向羅列，另外兩個胚珠的雙胚都是縱向羅列。這些雙胚都是小的胚靠近珠孔端生長，而較大的胚在合點端生長。

圖1 ～3.已透明的部分胚珠 圖4～6.剝離出的亞麻幼胚 圖7～9.剝離出的多胚亞麻雙胚顯微鏡下觀察到的多胚性亞麻種質的幼胚Fig.1 ～3 Parts of cleared flax ovules Fig.4～6 Isolated young embryos Fig.7～9 Isolted twin embryos of polyembryonic flax and young embryos observed under binocular microscopy

3 問題與討論

利用該技術對多胚受精后的胚珠進行整體透明并解剖，方法簡單，可節(jié)省染色和透明時間，并且能取得較好的觀察和采集3D數(shù)據(jù)的效果。通常，10%的次氯酸鈉溶液應用為漂洗液或消毒液，本試驗做為透明劑使用，與冬青油、丁香油、油鏡油等透明劑相比具有價格便宜、容易購買等優(yōu)點，并具有良好改變材料的透光性能。

在本試驗中，利用10%的次氯酸鈉溶液透明時，應將浸透種子的容器抽成真空，才能完全除去胚珠內的氣泡，否則胚珠內層的氣泡將使透明劑無法快速對胚珠進行浸潤、透明，在顯微鏡下出現(xiàn)不透明的黑色斑點，不能獲得較好的透明和觀察效果。本試驗利用該技術雖然對觀察和解剖多胚亞麻的胚珠取得了較好的效果，但也存在一定的缺點：當對試驗中所剝離到的雙胚進行DAPI以觀察染色體時，沒有獲得理想的染色效果。原因可能是DNA被強堿等水解。

多胚亞麻的幼胚顯微鏡下觀察的結果表明，受精7d以內的胚珠透明效果較好，受精8d以上的胚珠應增加堿解時間和透明時間；受精1～3d的胚珠很難剝離到幼胚；受精4～6天的胚珠是觀察和剝離幼胚最佳時期。

在以往的多胚材料發(fā)芽試驗中發(fā)現(xiàn)雙胚種子的兩條胚根可以從種子的不同部位發(fā)生，認為雙胚在胚珠中可能存在多種排列方式。但本試驗在同一胚囊內所觀察和解剖到的雙胚都呈縱向羅列方式，小胚靠近珠孔端生長，較大的胚在合點端生長。至于是否存在橫向或縱向并列等方式排列有待進一步探討。本試驗未觀察到三胚、四胚胚珠。

[1]王玉富，粟建光，等.亞麻種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006.

[2]J.M.Herr,Jr.,A New Clearing-Squash Technique for the Study of Ovule Development in Angiosperms[J].American Journal of Botany,1971,58(8):785-790.

[3]Crane.C.F.,Apomixis and crossing incompatibilities in some Zephyrantheae.Ph.D.Thesis,University of Texas,Austin,TX,1978.

[4]楊弘遠.用整體染色與透明技術觀察胚囊、胚、胚乳和胚狀體[J].植物學報,1986,28(6):572-581.

[5]楊弘遠.植物胚胎學中的整體透明技術[J].植物學報,1988,30(2):114-116.

[6]楊弘遠,周嫦.植物有性生殖實驗研究四十年[M].武漢:武漢大學出版社,2001.

[7]李正理.植物制片技術[M]..北京:科學出版社,1987.