納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨結(jié)合VEGF修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

顧曉東，梁慶威

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽110001）

如何理想的修復(fù)骨缺損一直是骨科領(lǐng)域的難題和研究熱點(diǎn)。自體骨及異體骨移植都存在難以克服的缺點(diǎn)。組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題提供了新的思路和方法。目前，支架材料和成骨活性因子聯(lián)用修復(fù)骨缺損也成為組織工程中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合骨模仿天然骨的成分及結(jié)構(gòu)特征，具有良好的生物相容性、優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性，可為細(xì)胞提供與天然骨相類似的微環(huán)境，這有助于骨系細(xì)胞的黏附、增殖及功能發(fā)揮［1～4］。血管內(nèi)皮生長因子能促進(jìn)人工骨的早期血管化和成骨，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨（nanohydroxyapatite/collagen，NHAC）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 修復(fù)大鼠橈骨缺損，采用10 ng、100 ng、300 ng的劑量梯度復(fù)合NHAC修復(fù)骨缺損，初步探討不同劑量VEGF修復(fù)骨缺損效果的差異以及VEGF用于骨缺損修復(fù)的適宜劑量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.1.2 試劑：納米羥基磷灰石粉末購自南京埃普瑞納米材料有限公司，膠原蛋白粉末購自湖州珍露生物制品有限公司。VEGF購自沈陽博爾美公司，由美國PeproTech公司生產(chǎn)。CD31抗體，購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備NHAC以及含有不同劑量VEGF的人工骨，人工骨制成后環(huán)氧乙烷消毒，無菌袋封存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 動(dòng)物分組、骨缺損模型的制備及材料植入：30只Wistar大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：空白組、單純 NHAC 植 入 組 、NHAC/10 ngVEGF、NHAC/100 ngVEGF、NHAC/300 ngVEGF，每組 6只（12側(cè)橈骨），其中前兩組為對照組，后3組為實(shí)驗(yàn)組。制備大鼠橈骨中段5 mm骨缺損模型，依據(jù)分組情況分別植入相應(yīng)材料，空白組不植入任何材料，關(guān)閉切口，不做內(nèi)外固定。術(shù)后肌注青霉素8萬U，連續(xù)3 d。

1.2.3 大體觀察：術(shù)后觀察動(dòng)物飲食、日?；顒?dòng)能力及術(shù)后傷口愈合情況。

1.2.4 組織學(xué)檢查：術(shù)后2、4、8周各組隨機(jī)選取2只動(dòng)物處死，截取橈骨缺損區(qū)骨段，常規(guī)制作石蠟標(biāo)本。每個(gè)標(biāo)本做厚度為5 μm的縱向切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察骨形成及塑型情況，并采用Lane-Sandhu法組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)評分。

1.2.5 免疫組織化學(xué)血管染色及血管計(jì)數(shù)：石蠟切片脫蠟水化后，一抗采用CD31抗體，常規(guī)ABC法行免疫組織化學(xué)染色。陽性染色表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒著色于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)100倍視野計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

術(shù)后各組大鼠活動(dòng)及進(jìn)食可，雙前肢腫脹，約1周左右腫脹消退，2周左右切口愈合，無感染化膿等不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。

2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色

術(shù)后2周：空白組骨斷端為纖維結(jié)締組織，NHAC組及各實(shí)驗(yàn)組有較多炎性細(xì)胞浸潤，有新生的島狀骨組織，各實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞生成較NHAC組多，其中NHAC/300 ngVEGF組的量在各實(shí)驗(yàn)組最多。4周：各組骨缺損斷端均可見軟骨成骨過程，并可見大量的成骨細(xì)胞，其中NHAC/300 ngVEGF組軟骨細(xì)胞量最高，NHAC組、各實(shí)驗(yàn)組的人工骨材料少量降解，部分區(qū)域有規(guī)則排列的骨小梁生成，骨小梁周圍可見類骨組織。術(shù)后8周：實(shí)驗(yàn)組的人工骨材料大部分已經(jīng)降解，新生骨組織的形成量實(shí)驗(yàn)組明顯高于NHAC組和空白組，其中NHAC/300 ngVEGF組的新骨形成量在各實(shí)驗(yàn)組中最多。實(shí)驗(yàn)組中可見大量成熟的板層狀骨組織，有規(guī)則的骨小梁形成，NHAC組新生骨的改建較各實(shí)驗(yàn)組少?？瞻捉M增生不活躍。見圖1。

2.3 Lane-Sandhu法組織學(xué)評分

除2周時(shí)NHAC組和NHAC/10 ngVEGF組織學(xué)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，各時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮生長因子/納米羥基磷灰石組組織學(xué)評分均高于納米羥基磷灰石組及空白組，其中以NHAC/300 ngVEGF組的評分在各組中最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.4 免疫組織化學(xué)血管計(jì)數(shù)

復(fù)合VEGF人工骨組在早期（2周）即有大量的血管生成，明顯多于NHAC組（P<0.05）；隨著人工骨的降解，新生血管逐漸增多，因此在4周內(nèi)各組血管逐漸增多（P<0.05）；而隨著新生骨的改造，不成熟的毛細(xì)血管逐漸被少數(shù)主要血管取代，血管數(shù)量減少，所以復(fù)合VEGF人工骨組在第8周時(shí)血管數(shù)量減少。其中NHAC/300 ng VEGF組血管數(shù)量在各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)最多。見表2。

3 討論

骨的血供十分豐富，血管生成對骨修復(fù)至關(guān)重要，新生血管不僅是氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的運(yùn)輸通道，而且可為骨修復(fù)提供所需的間充質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞。缺乏良好的血供將導(dǎo)致骨愈合不良［6］。許多研究表明，在骨折愈合過程中，血管的生成要先于新骨形成［7，8］。血管內(nèi)皮生長因子不僅能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、增殖，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管生成［9］。而且，VEGF能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、遷移、擴(kuò)增［10］。

局部單純應(yīng)用VEGF因缺乏可吸附的支撐物而被迅速降解或隨體液擴(kuò)散，從而不能均勻持久地分布在骨缺損部位，不但不能保證局部作用的發(fā)揮，而且還會產(chǎn)生異位成骨或血管瘤等并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)采用的NHAC是生長因子的良好載體，可以對附著的VEGF提供緩釋作用，從而使VEGF進(jìn)入體內(nèi)后不會快速擴(kuò)散和分解。

本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色表明，各實(shí)驗(yàn)組在2周時(shí)血管生長旺盛，為快速血管化階段，在4周時(shí)，血管數(shù)量達(dá)到高峰。隨著骨組織的成熟和改建，不成熟的毛細(xì)血管逐漸被少數(shù)主要血管取代，血管數(shù)量減少，在8周時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組血管數(shù)量下降。在各時(shí)間段，NHAC/300 ngVEGF組的血管數(shù)量最多，與其它各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而空白組和NHAC組的血管數(shù)量在8周時(shí)最多。這表明VEGF能促進(jìn)人工骨的早期血管化過程，并且隨著VEGF劑量的增加，血管的生成也增加。組織學(xué)表明各實(shí)驗(yàn)組對骨缺損的修復(fù)效果要優(yōu)于單純應(yīng)用NHAC，且隨著VEGF劑量的增加，骨缺損的修復(fù)效果增加。組織學(xué)評分以NHAC/300 ng VEGF組最高，和其它組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合了血管內(nèi)皮生長因子的NHAC比單純的納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨的骨修復(fù)能力更強(qiáng)。另外，血管化程度與新骨形成的數(shù)量呈正相關(guān)。正是由于血管的大量長入，使人工骨再血管化，從而為骨修復(fù)提供所需的間充質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)新生骨組織的形成。

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