一種新型玉米赤霉烯酮的定量檢測方法*

宋慧君，蔣丹，馬惠蕊 ，劉淑艷，曹遠(yuǎn)銀

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽，110161)

2(遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連，116001)

3(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所，農(nóng)業(yè)部北方農(nóng)作物病害免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽，110161)

一種新型玉米赤霉烯酮的定量檢測方法*

宋慧君1，2，蔣丹2，馬惠蕊 2，劉淑艷2，曹遠(yuǎn)銀3

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽，110161)

2(遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連，116001)

3(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所，農(nóng)業(yè)部北方農(nóng)作物病害免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽，110161)

采用間接競爭法原理和液相芯片技術(shù)平臺，選用玉米赤霉烯酮單克隆抗體(Monoclonal Anti-ZEN)對玉米赤霉烯酮(ZEN)定量檢測方法進(jìn)行探索。將ZEN-BSA與36﹟微球偶聯(lián)，同時加入待檢的游離的ZEN小分子和其標(biāo)記有生物素的ZEN單克隆抗體，偶聯(lián)抗原和目標(biāo)抗原競爭結(jié)合生物素標(biāo)記抗體，通過報告分子SA-PE在532 nm波長的激光下，即可檢測出報告分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢ZEN的量成反比。該研究優(yōu)化了液相反應(yīng)體系中ZEN單克隆抗?jié)舛?、確定了ZEN單抗臨界飽和濃度以及抗原抗體最佳孵育時間，其中ZEN單抗臨界飽和濃度為2.0 μg/mL，偶聯(lián)抗原和抗體最佳孵育時間為3h。研究所建立的ZEN液相芯片定量檢測方法，以國際通用的IC50作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，其檢測靈敏度為0.005 4 μg/mL，線性范圍為0.000 8～0.04 μg/mL。應(yīng)用該方法對脫脂牛奶和全脂牛奶進(jìn)行加標(biāo)回收檢測，平均回收率均大于75%。該方法簡化了樣品的純化和分離步驟，經(jīng)過實(shí)際樣品的檢測，證明方法靈敏、穩(wěn)定、快速、簡便，適用于大量樣本的檢測。

玉米赤霉烯酮，液相芯片技術(shù)，ZEN單抗，定量檢測

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又稱F-2毒素，主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等產(chǎn)生的2，4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，最初于1962年由Stob等［1］從污染了禾谷鐮刀菌的發(fā)霉玉米中分離得到。ZEN為白色晶體，分子式C18H22O5，熔點(diǎn)161℃～163℃ ，不溶于水，溶于堿性溶液、乙醚、苯及甲醇、乙醇等［2－3］。Plcinta對世界上近20個國家的谷物和動物飼料中的真菌毒素調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)國家的谷物和動物飼料中都不同程度地受到ZEN的污染［4］。據(jù)李榮濤等對我國各地玉米和小麥中ZEN進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)小麥中玉米赤霉烯酮陽性率為100%，濃度范圍為0.014～0.47 mg/kg，玉米中玉米赤霉烯酮陽性率為 100%，濃度范圍為 0.018 ～0.73 mg/kg［5］。

玉米赤霉烯酮的危害逐漸被人們所認(rèn)識。但它的定量檢測一直是個難點(diǎn)，目前的國標(biāo)方法是薄層色譜法和酶聯(lián)免疫法［6］。發(fā)達(dá)國家較多地采用色譜技術(shù)，樣品提取液用免疫親和柱凈化，這類方法高效、快捷、準(zhǔn)確，但成本較高;薄層層析法成本低，無需價格昂貴的儀器，但步驟較繁瑣，靈敏度不很高;高效液相色譜法靈敏度較高，但需昂貴的儀器，成本較高，且不能同時進(jìn)行多種毒素的同時檢測。酶聯(lián)免疫法雖準(zhǔn)確度差一些，但操作簡單、價格低廉［7－11］。液相芯片技術(shù)是近幾年剛剛興起的一種高通量檢測技術(shù)，集中了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、高分子化學(xué)、激光檢測、微流體、計算機(jī)等方面的先進(jìn)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)的多指標(biāo)自動化高通量檢測，也被稱為“液態(tài)生物芯片”［12－13］。利用液相芯片技術(shù)定量檢測ZEN原理是:在一種熒光微球表面交聯(lián)上ZEN蛋白純品，同時加入待檢的游離的ZEN小分子和其標(biāo)記有生物素的相應(yīng)抗體，這樣待檢的游離的ZEN小分子蛋白就會和交聯(lián)在微球表面的ZEB小分子蛋白純品競爭結(jié)合抗體，經(jīng)過洗脫后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白 (Streptavidin，R-phycoerythrin conjugate，SAPE)，SA-PE是一種新型熒光標(biāo)記試劑，易與抗體、生物素、親合素、免疫蛋白等物質(zhì)結(jié)合，在532 nm波長激光的激發(fā)下，可發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光，其熒光強(qiáng)度與待檢的小分子蛋白的量成反比，因此，可以對待檢小分子蛋白進(jìn)行定量檢測，原理示意圖如圖1所示［14－15］。液相芯片是一種通用性很強(qiáng)的技術(shù)平臺，可用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析等眾多領(lǐng)域。目前應(yīng)用較多的是細(xì)胞因子的檢測、病原體的檢測和分型以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測等［16－20］。目前，還未見報道用液相芯片技術(shù)檢測ZEN，本研究中筆者首次采用液相芯片技術(shù)平臺，應(yīng)用ZEN多單抗對ZEN液相芯片檢測方法進(jìn)行探索，以期建立ZEN相芯片定量測試方法。

圖1 小分子蛋白液相芯片檢測原理

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相芯片系統(tǒng)(Luminex 100型)，美國Luminex公司;旋渦振蕩器(TDX-1型)，北京方通達(dá)科技有限公司;金屬恒溫加熱器(HB-032型)，上海申能博彩生物科技有限公司;電子天平(JA2003型)，上海衡平儀器儀表廠;微量移液器(2.5～1000 μL)，德國eppdorf公司;ZEN單克隆抗體(Monoclonal Anti-ZEN，免疫抗原ZEN-OVA，鼠源，抗體類型為IgE，濃度4.08 mg/mL)，由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局生物實(shí)驗(yàn)室提供;玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(ZEN)，美國Sigma公司，10 mg;玉米赤霉烯酮-BSA(ZEN-BSA)，北京銳鑫農(nóng)科貿(mào)有限公司，1 mg;黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(AFB1)，美國Sigma公司，1 mg;藻紅蛋白(SA-PE)，美國Invitrogen公司，1 mg/mL，1 mL;36號羧基化熒光編碼微球(美國Luminex公司)，1.25×107個;微球偶聯(lián)緩沖液，磷酸鹽緩沖液，pH 7.4;微球封閉液:PBS內(nèi)含1%BSA，pH 7.4;蛋白生物素標(biāo)記試劑盒(EZLINK)，美國Pierce公司，10次);全脂牛奶和脫脂牛奶，市售。

1.2 方法

(1)參照Luminex說明書進(jìn)行，設(shè)計偶聯(lián)抗原ZEN-BSA用量為:100 μg;隨機(jī)選擇36號羧基化熒光編碼微球與上述抗原偶聯(lián)，標(biāo)識為:36﹟-100。

(2)抗體的生物素標(biāo)記:參照EZ-LINK試劑盒操作說明書進(jìn)行。

(3)ZEN液相芯片檢測方法的建立:主要包括反應(yīng)體系的優(yōu)化(偶聯(lián)抗原濃度、抗體濃度及孵育時間的優(yōu)化)，抗體飽和臨界濃度的確定，競爭法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立3個方面。

①反應(yīng)體系優(yōu)化 ZEN單克隆抗體濃度組為:0.2、0.4、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL;抗原抗體孵育時間，分別選擇1、3、6、15、24 h 以及48 h 六個不同時間段。在1.5 mL離心管中依次加入偶聯(lián)ZEN-BSA微球(可根據(jù)微球濃度調(diào)節(jié)加入的體積)，ZEN單克隆抗體，最后用PBS補(bǔ)足體積至100 μL。每個反應(yīng)體系按試驗(yàn)設(shè)計時間完成孵育后，加入4 μg/mL SAPE，25 μL/反應(yīng)體系，混勻，37℃避光孵育 30 min;取上述溶液，75 μL/反應(yīng)體系，液相芯片測試。

②ZEN單克隆抗體飽和臨界濃度確定:采用36-100偶聯(lián)微球進(jìn)行試驗(yàn)，孵育時間為3h;ZEN單克隆抗體濃度組為:0.2、0.4、1、2、3、4、5、6、7、8 μg/mL。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:采用36～100偶聯(lián)微球進(jìn)行試驗(yàn)，孵育時間為3h，ZEN單克隆抗體的濃度為2.0 μg/mL;ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品濃度組為:0、0.000 8、0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg/mL。

(4)ZEN牛奶樣品加標(biāo)回收測定采用36﹟-100偶聯(lián)微球進(jìn)行試驗(yàn)，孵育時間為3 h;分別選擇脫脂和全脂兩種類型的牛奶進(jìn)行測試，樣品添加回收水平分別設(shè)置低(0.75 ng/mL)、中(1.5 ng/mL)、高(2.0 ng/mL)3個水平。參照MaxSignalTMAflatoxin B1elisa test kit(BIOO Scientific Corp)說明書對牛奶樣本中添加的ZEN進(jìn)行提取，將添加ZEN牛奶于4℃冰箱中放置過夜，提取前將樣品于搖床中振蕩30 min，充分混勻;對于脫脂牛奶，用35%甲醇作10倍稀釋，于搖床中振蕩30 min，取50 μL稀釋后的樣品進(jìn)行檢測;對于含脂牛奶，取適量的牛奶樣品4 000 r/min離心5 min，除去上層脂肪層，用35%甲醇作10倍稀釋，取50μL稀釋后的樣品進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)檢測10次。

(5)數(shù)據(jù)分析:試驗(yàn)結(jié)果用Excel和 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEN液相芯片檢測反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

ZEN單抗?jié)舛燃翱乖贵w孵育時間優(yōu)化結(jié)果見圖1，其中圖中誤差線用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(STDEVP)。

圖1 ZEN單抗?jié)舛扰c抗體孵育時間反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

由圖1中數(shù)據(jù)得出:(1)隨著ZEN單克隆抗體濃度的增加，偶聯(lián)ZEN抗原與不同濃度單抗在同一孵育時間下檢測得到的熒光信號值基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)單克隆抗體濃度在2.0～16.0 μg/mL范圍內(nèi)時，檢測得到的熒光信號值最大。之后，隨著抗體濃度的繼續(xù)增加，熒光信號值呈現(xiàn)下降的趨勢。(2)隨著孵育時間的增加，同一濃度ZEN單克隆抗體與抗原反應(yīng)檢測得到的熒光信號值呈現(xiàn)逐步升高并最終穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)孵育時間為3～15 h時，檢測得到的熒光信號值最大。

方差分析結(jié)果見表1。由表1可知，單克隆抗體濃度以及孵育時間的影響均達(dá)到了極顯著水平(P≤0.01);2種因素影響大小順序分別為單抗?jié)舛龋痉跤龝r間。

表1 ZEN多抗?jié)舛燃胺跤龝r間方差分析結(jié)果

2.2 ZEN抗體飽和臨界濃度測定

圖2 ZEN單抗臨界飽和濃度散點(diǎn)圖

以ZEN單克隆抗體濃度為橫坐標(biāo)，以不同濃度單克隆抗體與偶聯(lián)ZEN-BSA微球反應(yīng)得到的熒光信號值(MFI)為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，見圖2。根據(jù)散點(diǎn)圖，選定 0 ～ 2.0 μg/mL、0 ～ 3.0 μg/mL、0 ～ 4.0 μg/mL 3個抗體濃度區(qū)間計算R2值，最大R2即為ZEN單抗飽和臨界濃度。測試結(jié)果排序依次是R12＞ R22＞ R32，表明單抗?jié)舛仍?～2.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。線性擬合結(jié)果見表2。

表2 ZEN單克隆抗體不同濃度區(qū)間試驗(yàn)數(shù)據(jù)線性擬合結(jié)果

2.3 ZEN液相芯片定量檢測方法的建立

采用ZEN單抗和36﹟-100偶聯(lián)微球檢測得到的R2為0.997 4，符合定量實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，表明競爭法標(biāo)準(zhǔn)曲線成功建立，如圖4所示。

圖3 采用ZEN單抗液相芯片競爭法檢測ZEN標(biāo)準(zhǔn)曲線

以抑制率達(dá)到50%時的ZEN濃度做為靈敏度標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明:采用ZEN單抗進(jìn)行檢測得到的IC50為0.005 4μg/mL，線性范圍為 0.000 8 ～ 0.04 μg/mL。結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度和線性范圍

2.4 牛奶樣品添加回收率測定

以脫脂牛奶和全脂牛奶為試驗(yàn)樣本，進(jìn)行ZEN添加回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表4。結(jié)果表明添加低值、正常值、和高值ZEN所對應(yīng)的回收率均大于75%，變異系數(shù)均低于5%，檢測水平符合毒素殘留分析的要求。

3 結(jié)語

ZEN屬于小分子毒素中的一種，采用液相芯片技術(shù)定量檢測小分子毒素還鮮有報道。本研究中筆者首次采用液相芯片技術(shù)平臺，應(yīng)用ZEN單克隆抗體成功建立了ZEN液相芯片定量檢測方法，以國際通用的IC50作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，其檢測靈敏度為0.005 4 μg/mL，線性范圍為 0.000 8 ～0.04 μg/mL。應(yīng)用該方法對脫脂牛奶和全脂牛奶進(jìn)行加標(biāo)回收檢測，在添加水平為0.75～2.0 ng/mL，平均回收率均大于75%。

采用液相芯片技術(shù)檢測玉米赤霉烯酮有如下優(yōu)點(diǎn):(1)整個反應(yīng)在液相體系中進(jìn)行，大大提高了反應(yīng)的靈敏度，減少了假陽性的概率;(2)抗原與微球采用化學(xué)法進(jìn)行偶聯(lián)，且偶聯(lián)微球與抗體結(jié)合的比表面積相對較大，相對于物理性的非特異結(jié)合，液相芯片的整個反應(yīng)更加充分，更加穩(wěn)定;(3)該方法簡化了樣品的純化和分離步驟，經(jīng)過實(shí)際樣品的檢測，證明具有比傳統(tǒng)檢測法更簡便、更經(jīng)濟(jì)、更靈敏的特點(diǎn)，適用于大批量樣品的快速檢測。

食品安全關(guān)系國計民生，將液相芯片檢測技術(shù)引入ZEN測試中來，提高了對ZEN的檢測水平，從而提高了對ZEN的監(jiān)管水平及污染控制。

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A New Method for the Zearalenone Quantitative Detection

Song Hui-jun1，2，Jiang Dan2，Ma Hui-rui2，Liu Shu-yan2，Cao Yuan-yin3
1(Shenyang Agricultural University，Shenyan 110161，China)
2(Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Burau，Dalian 116001，China)
3(Institute of Plant Immunology Shenyang Agricultural University，Shenyan 110161，China)

The quantitative detection of Zearalenone(ZEN)was investigated on the microsphere array technology platform and indirect competition theory．In this research，Monoclonal Anti-ZEN was chosen and labeled by biotin．ZEN-BSA was coupled with 36﹟microsphere，then it was added in the 1．5mL centrifuge tube with the free target antigen and the biotin labeled Monoclonal Anti-ZEN．Botin labeled Monoclonal Anti-ZEN was competitive bound by the coupling antigen and the free target antigen，and the target antigen was detected by the report molecule SA-PE which was stimulated fluorescence at 532nm laser light．The fluorescence intensity was inversely proportional to the concentration of the free target antigen．Through optimizing the concentration of the critical saturated Monoclonal Anti-ZEN and determining the incubation time of antigen and antibody，the quantitative detection of ZEN was established eventually．In this research，the critical saturated concentration of Monoclonal Anti-ZEN was 2．0 μg/mL，the best incubation time of antigen and antibody was 3h．As referring of the international current standard of IC50，the results showed that the sensitivity was 0．0054 μg/mL，the detection range of the standard curve was 0．0008 ～0．04 μg/mL．By applying the research method in skim milk and full milk contamination testing，the recovery rate of the two kinds of milk was both greater than 75%．The procedure of purification and separation of the sample were simplified by using this method．Overall，the quantitative analysis of ZEN using the microsphere array technology is sensitive，stable，rapid，and simple，and it is applicable for mass sample testing．

ZEN，microsphere array technology，Anti－ZEN，quantitative detection

在讀博士研究生(曹遠(yuǎn)銀研究員為通訊作者)。

*國家質(zhì)檢總局資助項(xiàng)目

2011－04－07，改回日期:2011－07－11