毛霉AS3.2778脯氨酸氨肽酶的部分純化及性質(zhì)研究*

潘進(jìn)權(quán)

(湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江，524048)

毛霉AS3.2778脯氨酸氨肽酶的部分純化及性質(zhì)研究*

潘進(jìn)權(quán)

(湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江，524048)

毛霉蛋白酶對大豆蛋白有較高的水解效率并對蛋白水解物有良好的脫苦效果，因此在大豆多肽的制備方面顯示出很好的應(yīng)用前景。為了開發(fā)這一蛋白酶系，實(shí)驗(yàn)中P采用硫酸銨鹽析、離子交換層析、疏水層析及凝膠層析等方法對其進(jìn)行了分離純化，從雅致放射毛霉AS3.2778的發(fā)酵麩曲中部分純化得到一氨肽酶組分，并對其性質(zhì)進(jìn)行了探討。純化的毛霉氨肽酶是一典型的脯氨酸氨肽酶，它對小肽N端的脯氨酸有非常強(qiáng)的水解能力;該氨肽酶在40～45℃、pH6.5有最大催化活性，在30℃以內(nèi)，pH5.0～8.0有很好的穩(wěn)定性;在所試驗(yàn)的幾種蛋白酶抑制劑中，僅1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)對毛霉氨肽酶有抑制作用，由此說明純化的毛霉氨肽酶可能是一種絲氨酸蛋白酶;常見金屬離子對該氨肽酶活性的影響不明顯;脫苦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化的毛霉氨肽酶對于大豆蛋白水解物的苦味有明顯的去除效果。

雅致放射毛霉，脯氨酸氨肽酶，純化，性質(zhì)。脫苦

毛霉是腐乳發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌種之一，在腐乳生產(chǎn)工藝中主要是分泌蛋白酶水解豆腐胚內(nèi)的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白質(zhì)主要是以多肽形式存在，具有相當(dāng)高的水解程度，已經(jīng)從中分離出多種具有生理活性的多肽［1－2］。對眾多腐乳產(chǎn)品的感官分析表明，腐乳產(chǎn)品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。因此毛霉蛋白酶在解決植物蛋白(尤其是大豆蛋白)水解率低、水解產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的苦味等難題方面具有很大的潛力。

目前行業(yè)內(nèi)僅有少數(shù)學(xué)者對毛霉的發(fā)酵產(chǎn)酶特性以及粗酶的催化、水解特性進(jìn)行過探討［3－4］。然而，毛霉由于長期受到高蛋白環(huán)境條件的馴化，它通常具有合成及分泌多種胞外蛋白酶的能力，其胞外的蛋白酶系是由多種蛋白酶所構(gòu)成的復(fù)雜體系，因此，單純從總體上(即粗酶的研究)并不能完全了解其內(nèi)在的特性。為全面了解這一蛋白酶系的組分構(gòu)成、各組分的催化特性以及相互之間的作用，課題組開展了相關(guān)的研究。在前期的工作中，對毛霉胞外的內(nèi)肽酶組分進(jìn)行了分離純化及性質(zhì)分析，并考察了它們對大豆蛋白的水解特性［5－6］。結(jié)果表明，毛霉胞外主要有3個(gè)內(nèi)肽酶組分，包括一個(gè)堿性蛋白酶和兩個(gè)酸性蛋白酶，堿性蛋白酶與酸性蛋白酶之間有一定的肽鍵選擇互補(bǔ)性，兩者共同作用于大豆蛋白可以實(shí)現(xiàn)大豆蛋白的深度水解。然而，感官分析卻發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白的毛霉內(nèi)肽酶水解物也有強(qiáng)烈的苦味。由此看來，在毛霉胞外可能存在一些具有脫苦效果的蛋白酶組分［7］，為此，我們對毛霉胞外的氨肽酶組分進(jìn)行了分離純化并對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雅致放射毛霉Actinomucor elegans AS3.2778(發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種);DEAE-Sepharosee、Phenyl-Sepharose、Sephadex G50購自Pharmacia公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA、E-64、Pepstatin，購自 Amersco公司;Gly-Pro-pNA、Gly-pNA、Pro-pNA、Arg-pNA、LeupNA、Val-pNA等，購自 Sigma公司;大豆分離蛋白(SPI，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.35%)，購自哈爾濱高科大豆食品有限公司;Alcalase蛋白酶，購自Novo公司;其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶活性測定

采用 Folin-酚法［8］。1.5 mL離心管中加入0.3 mL適當(dāng)稀釋的酶液及0.3 mL 1.5%酪蛋白(溶于0.05 mol/L pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液)，40℃反應(yīng)l0min，再加0.6 mL 0.4mo1/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置15 min后14 000×g離心10min，取上清液0.6 mL，加入3 mL 0.4 mol/L NaCO3溶液及0.6 mL福林酚試劑，于40℃顯色20 min，于680 nm測其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活單位。

1.2.2 氨肽酶活性測定［9］

150 μL 酶液加入 150 μL 0.2 mmol/L L-脯氨酸-對硝基苯胺，混勻后置于35℃水浴反應(yīng)20 min，沸水浴滅活3 min。然后用微量比色皿測定405 nm吸光度。以150 μL滅活的酶液加150 μL 0.2 mmol/L L-脯氨酸-對硝基苯胺作為空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。

酶活定義:實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘水解L-脯氨酸-對硝基苯胺(Pro-pNA)產(chǎn)生1μg對硝基苯胺所需酶量即為1個(gè)酶活單位。

1.2.3 粗酶的提取

稱取一定量干麩曲(發(fā)酵方法見文獻(xiàn)［10］)加入10倍體積的0.3 mol/L NaCl溶液，混勻后于30℃水浴中抽提1.5h，紗布過濾后在4℃，7 000×g離心10 min，取上清液即得到粗酶液。

1.2.4 毛霉氨肽酶的純化

1.2.4.1 (NH4)2SO4分段鹽析

取一定體積的粗酶液，在冰水浴上緩慢加入固體(NH4)2SO4到飽和度為50%，充分溶解后在4℃冰箱中靜置4h，于4℃，12 000×g離心20 min，取上清液繼續(xù)加入固體(NH4)2SO4至飽和度為70%，4℃冰箱中靜置12 h，然后于4℃，12 000×g離心20 min，蛋白沉淀用0.02 mol/L，pH值7.5的Tris-HCl緩沖液溶解，并透析脫鹽。

1.2.4.2 DEAE-Sepharose陰離子交換

用0.02 mol/L，pH7.5的 Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sepharose陰離子交換柱(3.0 cm×30 cm)，取一定量鹽析脫鹽后的酶液，加樣陰離子交換柱。用平衡緩沖液充分洗柱后，用A液:0.02 mol/L，pH7.5的Tris-HCl緩沖液;B液:0.5 mol/L NaCl溶液(溶于0.02 mol/L，pH7.5的Tris-HCl緩沖液)進(jìn)行階梯等度洗脫，流速1.5 mL/min，收集50%B階梯洗脫蛋白峰，然后用超濾離心管濃縮收集液。

1.2.4.3 Phenyl-Sepharose疏水層析

用1.2 mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.05 mol/L，pH 7.5的PBS緩沖液)平衡Phenyl-Sepharose疏水層析柱(1.6 cm×20 cm)。將上一步收集的濃縮酶液與2.4 mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.1 mol/L，pH7.5的PBS緩沖液)等體積混和后加樣Phenyl-Sepharose疏水層析柱，用平衡緩沖液充分沖洗疏水柱，然后用A液:0.05 mol/L，pH7.5的PBS緩沖液;B液:1.2 mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.05 mol/L，pH7.5的PBS緩沖液)進(jìn)行階梯等度洗脫，流速1.0 mL/min。收集60%B階梯洗脫蛋白峰(即脯氨酸氨肽酶蛋白峰)。

1.2.4.4 Sephadex G50凝膠過濾層析

用0.02 mol/L，pH7.5 PBS緩沖液平衡Sephadex G50凝膠柱(1.6 cm×100 cm)，分別加樣1.2.4.2和1.2.4.3的濃縮酶液，用0.02 mol/L，pH7.5的 PBS緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min。收集活性蛋白峰，用超濾離心管濃縮收集的樣品。

1.2.5 毛霉氨肽酶的催化性質(zhì)

1.2.5.1 毛霉氨肽酶的底物選擇性

按照氨肽酶活性測定方法，分別以Gly-Pro-pNA、Gly-pNA、Pro-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA、Val-pNA 等為底物，測定毛霉氨肽酶對不同底物的水解活性。

1.2.5.2 毛霉氨肽酶的最適作用溫度

按照酶活測定方法分別于不同的溫度(30～70℃)下測定毛霉氨肽酶的活性，考察溫度對毛霉氨肽酶活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制溫度－活力曲線，并由此確定毛霉氨肽酶的最適作用溫度。

1.2.5.3 毛霉氨肽酶的最適作用pH

按照酶活測定方法分別于不同pH緩沖條件下(pH 3.0～5.0，0.05 mol/L乙酸緩沖鹽;pH6.0～7.0，0.05 mol/L 磷酸緩沖鹽;pH 8.0～9.0，0.02 mol/L Tris-HCl;pH 9.5 ～10.5，0.02 mol/L glycine-NaOH)測定毛霉氨肽酶的活性，考察pH對毛霉氨肽酶活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制pH-活力曲線，并由此確定毛霉氨肽酶的最適作用pH范圍。

1.2.5.4 毛霉氨肽酶的熱穩(wěn)定性

在氨肽酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液分別于不同溫度(30～70℃)下保溫30 min，測定保溫前后氨肽酶活性的變化，考察溫度對氨肽酶穩(wěn)定性的影響。以酶活殘留率對溫度作圖，繪制氨肽酶熱失活曲線。

1.2.5.5 pH值對毛霉氨肽酶穩(wěn)定性的影響

用不同的緩沖液分別調(diào)節(jié)酶液的pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于25℃放置約1 h，測定放置前后酶活，計(jì)算酶活殘留率。以酶活殘留率對pH值作圖，繪制氨肽酶的pH穩(wěn)定曲線。

1.2.5.6 抑制劑對毛霉氨肽酶活性的影響

在酶的穩(wěn)定pH值條件下，將酶液與不同類型的抑制劑混和，25℃下放置約30 min，測定加入抑制劑保溫后氨肽酶的活性?？疾煲种苿Π彪拿富钚缘挠绊憽?/p>

1.2.5.7 金屬離子對蛋白酶活性的影響

在酶的穩(wěn)定pH值條件下，將酶液與不同的金屬離子溶液混和，于室溫中放置30min后測定酶活，比較各種金屬離子對氨肽酶活性的影響。

1.2.6 大豆多肽的制備

用蒸餾水配制5 g/100 mL大豆分離蛋白，用1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至pH值11.0，置于90℃恒溫水浴中預(yù)處理15min，冷卻后按酶活與底物比為3 000 u/g加入Alcalase堿性蛋白酶，置于50℃的水浴中保溫酶解5h。水解結(jié)束后直接加熱煮沸，并趁熱過濾，濾液冷凍干燥，即得到大豆多肽樣品。

1.2.7 苦味評價(jià)方法

以硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)對照物，采用感官分析的方法對大豆多肽的苦味進(jìn)行了評價(jià)，大豆多肽苦味強(qiáng)度以具有相同苦味的硫酸奎寧摩爾濃度表示［11］。配制一定摩爾濃度的硫酸奎寧溶液，分別稀釋到 10－4、10－5、10－6、10－7、10－8mol/L，對應(yīng)的苦味強(qiáng)度分別為:強(qiáng)、較強(qiáng)、中、弱、無。感官評定小組由8人組成，評定人員用蒸餾水漱口后，取待測水解液3～5 mL置于口中，10 s后吐出，漱口后取與之苦味程度相近的標(biāo)準(zhǔn)液品嘗，如確認(rèn)兩苦味相近，即可把待測水解液定義為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值，否則取其他標(biāo)準(zhǔn)液品嘗，直至確定其苦味值。

1.2.8 毛霉氨肽酶脫苦效果的分析

用pH6.5，0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液配制3%大豆多肽溶液，按氨肽酶酶活與底物比為3 000 u/g加入純化后的氨肽酶，置于35℃水浴保溫3 h，每隔一定時(shí)間取樣進(jìn)行苦味感官分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛霉氨肽酶的初步純化

采用層析的方法對毛霉胞外的氨肽酶進(jìn)行了初步的分組分離及純化。首先，采用DEAE-Sepharose陰離子交換層析對鹽析后樣品進(jìn)行了初步的分離純化，通過對其洗脫方法進(jìn)行優(yōu)化，最終使氨肽酶組分完全集中在50%B的洗脫峰(如圖1示)，并實(shí)現(xiàn)了內(nèi)肽酶與氨肽酶的分離，同時(shí)使氨肽酶得到了濃縮;然后，采用疏水層析的方法對上一步收集的氨肽酶樣品做進(jìn)一步的分離(如圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在疏水層析中可以分離得到2個(gè)有活性的洗脫峰，即60%B洗脫峰(活性峰1)和20%B洗脫峰(活性峰2)，據(jù)此可以初步確定，毛霉胞外至少有2個(gè)不同的氨肽酶組分;相比而言，峰1的氨肽酶活性要強(qiáng)得多，峰2僅為其活性的30%左右;最后，采用凝膠層析的方法對疏水層析收集的活性峰1進(jìn)行了進(jìn)一步的純化(如圖3)，并同時(shí)對樣品進(jìn)行脫鹽處理。

圖1 氨肽酶DEAE-Sepharose離子交換洗脫曲線

圖2 氨肽酶Phenyl-Sepharose疏水層析洗脫曲線

圖3 氨肽酶組分AP1凝膠層析洗脫曲線

通過以上一系列的純化操作，雖然可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)肽酶與氨肽酶的分離，2個(gè)氨肽酶組分之間也得以分開，氨肽酶的純度有所提高，但是最終并不能完全純化出目標(biāo)蛋白。純化得到的氨肽酶樣品中仍然含有一定量的雜蛋白。因此，對毛霉氨肽酶的純化還需考慮其他的方法。

2.2 毛霉氨肽酶的底物專一性

毛霉氨肽酶對不同底物的水解活性如表1所示。毛霉氨肽酶對不同底物的水解活性顯示出一定的差異?？偟膩砜?，毛霉氨肽酶主要對小肽N端疏水性氨基酸，如Pro、Leu、Ile、Phe構(gòu)成的肽鍵有很強(qiáng)的水解活性;而對小肽N端非疏水性氨基酸，如Arg、Ala、Gly構(gòu)成的肽鍵水解活性非常弱，甚至無水解活性。比較毛霉氨肽酶對表中底物的水解活性來看，該氨肽酶對Pro-pNA有最大的水解活性，是一脯氨酸氨肽酶。

表1 毛霉氨肽酶的底物專一性

2.3 抑制劑及金屬離子對毛霉氨肽酶活性的影響

抑制劑及金屬離子對毛霉氨肽酶活性的影響見表2。結(jié)果表明，在所試驗(yàn)的幾種蛋白酶抑制劑中，僅1 mmol/L的PMSF對氨肽酶有部分抑制作用，但不能完全抑制其活性。由此說明，毛霉氨肽酶可能是一種絲氨酸蛋白酶，但其催化特性及結(jié)構(gòu)不同于一般的絲氨酸蛋白酶;常見金屬離子對毛霉氨肽酶活性的影響不明顯。

表2 抑制劑及金屬離子對毛霉氨肽酶活性的影響

2.4 pH值對毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響

pH值對毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖4所示。與毛霉內(nèi)肽酶相比，毛霉氨肽酶的pH-活性曲線相對較窄，pH值對其活性的影響非常顯著。毛霉氨肽酶在pH值6.5左右有最大催化活性，而在pH值5.0時(shí)，氨肽酶的活性僅為最大活性的50%左右。此外，毛霉氨肽酶在中性附近(pH值5.0～8.0)有相對較好的穩(wěn)定性，當(dāng)pH值低于5.0時(shí)該氨肽酶會(huì)迅速的變性失活。

圖4 pH對毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響

2.5 溫度對毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響

溫度對毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖5所示。在相對較低的溫度(25～45℃)下，毛霉氨肽酶活性隨溫度的升高變化的幅度較平緩;當(dāng)溫度超過45℃后，酶活會(huì)迅速下降;該氨肽酶在40～45℃的范圍內(nèi)有最大催化活性，然而其在25℃下也顯示出相對較高的活性，約為最大活性的50%，這可能與該酶相對較低的熱穩(wěn)定性有一定的關(guān)系。由于在相對較低的溫度(25～45℃)下，酶已經(jīng)有一定程度的失活，因此表現(xiàn)出溫度升高對促進(jìn)反應(yīng)速度的加速效應(yīng)不顯著。圖5B的結(jié)果確實(shí)顯示，毛霉氨肽酶的熱穩(wěn)定性相對較差，其在30℃以內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度超過40℃酶會(huì)迅速失活。例如，在40℃保溫30 min后，酶活大約有10%的損失;在50℃保溫30min后，酶活完全喪失。

圖5 溫度對毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響

2.6 毛霉氨肽酶脫苦效果的分析

純化的毛霉氨肽酶對大豆多肽的脫苦效果如圖6所示。毛霉氨肽酶對大豆多肽有顯著的脫苦效果，隨著脫苦反應(yīng)的進(jìn)行，大豆多肽的苦味逐漸減弱并最終消除。在氨肽酶脫苦的初期，大豆多肽的苦味變化極為顯著;初始3%的大豆多肽溶液有很強(qiáng)烈的苦味，用氨肽酶脫苦處理0.5 h后，其苦味明顯減弱為中等強(qiáng)度;脫苦處理1 h后，其苦味已非常弱(略有微弱的苦味);脫苦處理3 h后，大豆多肽的苦味完全消失。

圖6 大豆多肽脫苦過程中苦味的變化

毛霉氨肽酶對大豆多肽有顯著的脫苦效果，這應(yīng)該與該氨肽酶選擇性切除小肽N端的疏水性氨基酸有密切關(guān)系。已有的研究表明，多肽之所以有苦味主要與其疏水性有關(guān)，尤其是位于小肽分子兩端的疏水性氨基酸對肽的苦味有很大的貢獻(xiàn)［12－13］。因此，氨肽酶對小肽N端疏水性氨基酸的切除可以從根本上解除小肽的苦味，這一結(jié)論已為較多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)［14－16］。此外，從毛霉氨肽酶的底物專一性來看，毛霉氨肽酶對小肽N端的非疏水性氨基酸作用甚微，這將可以有效避免脫苦過程中對小肽的過度水解，脫苦后水解液中依然以小肽為主，這對于小肽類產(chǎn)品功能特性的保留有重要的意義。綜合來看，毛霉氨肽酶作為新型的風(fēng)味酶在多肽的脫苦方面有較好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

利用多種層析操作相結(jié)合的方法從雅致放射毛霉AS3.2778的發(fā)酵麩曲中分離純化出一氨肽酶組分，并對其性質(zhì)及脫苦效果進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:該蛋白酶是一脯氨酸氨肽酶;在40～45℃、pH6.5有最大催化活性，在30℃以內(nèi)，pH5.0～8.0有很好的穩(wěn)定性;該氨肽酶對小肽N端的疏水性氨基酸有很強(qiáng)的水解活性，而對小肽N端非疏水性氨基酸的水解活性極弱;脫苦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛霉氨肽酶對大豆蛋白水解物有顯著的脫苦效果。在3%的大豆多肽溶液中，按酶活與底物比3 000u/g加入毛霉氨肽酶處理3h可以完全消除大豆多肽的苦味。以上結(jié)果表明，毛霉氨肽酶酶組分作為新型的風(fēng)味酶在多肽的脫苦方面有較好的應(yīng)用潛力。

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Partial Purification and Properties of One Prolyl-aminopeptidase from Mucor AS3.2778

Pan Jin-quan
(School of Life Science and Technology，Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048，China)

Proteases from Mucor had a good application prospect in the production of soy-polypeptides for their high hydrolysis efficiency to soy protein and debittering effect to hydrolysate.To explore these proteases，this study used ammonium sulfate precipitation，ion exchange chromatography，hydrophobic chromatography and gel filtration chromatography，and investigated the properties of one aminopeptidase purified from the fermented wheat bran by Actinomucor elegans AS3.2778.The purified aminopeptidase was a particular prolyl-aminopeptidase，which had a very high hydrolysis activity to N-terminal proline of peptides.It had the maximum activity at pH6.5 40 ～45℃，was stable in the pH range of 5.0 ～8.0 at ＜30℃，and could be inhibited by the serine protease inhibitor，PMSF，indicated that it may belong to the serine protease family.The effect of debittering for bitter peptides among SPI hydrolysate with Alcalase was clearly found by proly-aminopeptidase treatment for 3 h.

Actinomucor elegans，prolyl-aminopeptidase，purification，properties，debittering

博士研究生，講師。

*廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(9452404801001943);湛江師范學(xué)院基金項(xiàng)目(ZL0912)

2010－11－09，改回日期:2010－12－09