三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

鞏 芳，尹震花，顧雪竹，顧海鵬，康文藝＊

（1.河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開封475000；2.中國(guó)中醫(yī)研究院 中藥研究所，北京100700）

三白草Saururus chinensis（Lour.）Baill為三白草科三白草屬植物，別名塘邊藕，產(chǎn)于河北、山東、河南和長(zhǎng)江流域及其以南各省區(qū)，生于低濕溝邊、塘邊或溪邊。日本、菲律賓及越南也有分布。全株藥用，內(nèi)服治療尿路感染、尿路結(jié)石、腳氣水腫及營(yíng)養(yǎng)性水腫；外敷治療癰瘡癤腫、皮膚濕疹等［1］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者［2－7］對(duì)其研究發(fā)現(xiàn)，三白草中有揮發(fā)油、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質(zhì)等化學(xué)成分。藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎［8－9］、降 血 糖［10－13］、解 毒、抗 菌、抗 氧 化［14－16］、保肝［17－18］、利尿等藥理作用。

α－葡萄糖苷酶抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸內(nèi)α－葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效緩解餐后高血糖。由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治，臨床上主要使用阿卡波糖和伏格列波糖等。國(guó)內(nèi)外對(duì)三白草的降血糖作用已有報(bào)道，但是主要集中在體內(nèi)的研究，未見文獻(xiàn)對(duì)α－葡萄糖苷酶抑制活性的報(bào)道。我們利用體外抑制α－葡萄糖苷酶模型，首次對(duì)三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Electron公司）；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；DELTA 320型pH 計(jì)（美國(guó) Mettler Toledo公司）；電子天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；TGL-16高速離心機(jī)（江蘇金壇市中大儀器廠）。

α-葡萄糖苷酶 （α－glucosidase，EC 323-604-7），4－硝 基 苯－α-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷 （4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026-K1516），阿 卡 波 糖（Acarbose，Lot 16869），二甲亞砜（DMSO）均購自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析醇。

三白草于2010年7月采集于河南省新縣大別山區(qū)，由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤副教授鑒別為三白草科三白草屬植物三白草Saururu chinensis（Lour.）Baill，標(biāo)本存于河南大學(xué)中藥研究所。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 三白草浸膏的提取

將三白草全草陰干，粉碎，用甲醇室溫下浸泡3次，每次3d，合并提取濾液后濃縮，得到甲醇總浸膏?？偨喾稚⒂谒?，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮得到三白草石油醚部位（SBPE）、乙酸乙酯部位（SBEA）、正丁醇部位（SBBU）。

2.2 α－葡萄糖苷酶抑制活性的篩選方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 根據(jù)采用的反應(yīng)體系，用磷酸緩沖液 （pH 6.8）配制1 000μmol／L PNP，稀釋成400、300、200、150、100、50、25、5、0μmol／L。分別取7種不同濃度的PNP溶液各160μL，加入0.2μmol／L Na2CO3溶液80μL，混勻，在405nm下測(cè)定OD值，測(cè)3組，取平均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 α－葡萄糖苷酶活力的測(cè)定 根據(jù)所采用的反應(yīng)體系，112μL磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）加入200U／L α-葡萄糖苷酶20μL 、DMSO 8μL，37℃ 恒溫，15min后加入2.5mmol／L PNP 20μL，搖勻，37℃恒溫反應(yīng)15min，再加入0.2mol／L Na2CO3溶液80μL，于405nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

酶活力單位定義：37℃、pH 6.8條件下，1min水解底物所產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量，規(guī)定為1個(gè)酶活力單位（U）［19］。

2.2.3 檢測(cè)方法 將三白草各提取物以DMSO溶解，并存儲(chǔ)于4℃ 冰箱中。以張麗等［20－22］建立的96微孔板篩選方法，405nm處檢測(cè)其OD值，同時(shí)做相同體系下的樣品空白組，不加樣品、酶與底物的空白對(duì)照組，不加樣品的陰性對(duì)照組和以阿卡波糖為抑制劑的陽性對(duì)照組，并用Origin軟件求出相應(yīng)的IC50值。

酶活性抑制率（%）＝（OD樣品陰性－OD樣品空白）／（OD 陰性－OD 空白）×100%。

3 結(jié)果與討論

3.1 三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

3個(gè)提取物中，乙酸乙酯部位（IC50＝122.7mg／L）α－葡萄糖苷酶抑制活性最高，其次為石油醚 部 位 （IC50＝203.3mg／L）和 正 丁 醇 部位（IC50＝659.9mg／L），3個(gè)提取物活性均遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照組阿卡波糖（IC50＝1 103.01mg／L），表明三白草提取物具有好的α－葡萄糖苷酶抑制活性，見表1。

表1 三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

初篩時(shí)，在同一質(zhì)量濃度下（1 500mg／L），三白草3個(gè)提取物α－葡萄糖苷酶抑制率從大到小依次為石油醚部位＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位，且初篩抑制率均高于陽性對(duì)照組阿卡波糖。但是，初篩時(shí)抑制率大，IC50值不一定大，由此可見，僅從抑制率評(píng)價(jià)其活性并不可靠，應(yīng)結(jié)合IC50值綜合判斷。為進(jìn)一步研究抑制活性，對(duì)三白草提取物的初篩濃度依次對(duì)半稀釋，并進(jìn)行IC50計(jì)算，見圖1。

圖1 三白草不同提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

3.2 提取物質(zhì)量濃度對(duì)α－葡萄糖苷酶抑制活性的影響

三白草3種提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性均隨濃度增加而增加，呈濃度依賴性。三白草石油醚部位和乙酸乙酯部位，在質(zhì)量濃度為300mg／L時(shí)，抑制率已經(jīng)達(dá)到73.38%和74.45%，此后再增加提取物濃度，抑制活性緩慢增加；正丁醇部位α－葡萄糖苷酶抑制活性幾乎隨濃度增加而增加，見圖2。

圖2 提取物質(zhì)量濃度對(duì)α－葡萄糖苷酶抑制活性的影響

4 結(jié)論

我們采用α－葡萄糖苷酶體外抑制模型對(duì)三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)三白草提取物均具有一定的α－葡萄糖苷酶抑制活性，且提取物的活性高于陽性對(duì)照組阿卡波糖。另外，各提取物的抑制活性均與濃度呈正相關(guān)性，說明其抑制活性具有濃度依賴性。

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