高廣春,鄭許松,徐紅星,呂仲賢
浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所,杭州310021
糖蜜草揮發(fā)性成分HS-SPME-GC-MS分析
高廣春,鄭許松,徐紅星,呂仲賢*
浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所,杭州310021
本文首次采用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)提取該植物揮發(fā)性成分,然后通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GCMS)結(jié)合保留指數(shù)以及標(biāo)樣對照對化學(xué)成分進行了定性,并通過峰面積歸一化法計算出各組分的相對百分含量。試驗確定了PDMS/DVB固相微萃取對糖蜜草揮發(fā)物的萃取效果最好,并從中鑒定出33種化合物占總揮發(fā)性成分的90.94%,主要為烷烴和萜烯類化合物。該研究為開發(fā)糖蜜草作為水稻螟蟲的驅(qū)避植物進行害蟲安全有效防治提供理論依據(jù),并為驅(qū)避性揮發(fā)物的田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
糖蜜草;固相微萃取;氣質(zhì)聯(lián)用;揮發(fā)性成分;
植物與植食性昆蟲之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系,它們共同進化、共同發(fā)展[1]。植物為了抵御害蟲的侵害在進化過程中成功的“制造”出一系列天然的次生代謝物,其中包括具有直接毒性或是驅(qū)避性化合物和對天敵具有引誘作用的化合物等[2]。植物釋放的易揮發(fā)性化合物是植食性昆蟲尋找寄主植物的重要線索,它調(diào)控著昆蟲的定向、識別、取食等行為[3]。農(nóng)業(yè)上可以利用目標(biāo)作物與害蟲的這一化學(xué)信息聯(lián)系對害蟲進行引誘、驅(qū)避、迷向等外界干擾達到害蟲的安全防治。在我國鱗翅目害蟲大螟(Sesamia inferens,夜蛾科)和二化螟(Chilo suppressalis,螟蛾科)是危害水稻最重要的常發(fā)性害蟲,也是茭白、甘蔗、玉米等作物上的重要害蟲。近年來,由于優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻品種和免耕栽培等新技術(shù)的推廣、全球變暖、大量使用農(nóng)藥導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生等原因使水稻螟蟲的種群數(shù)量和成災(zāi)面積大幅度上升,給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。目前螟蟲防治主要通過施用化學(xué)農(nóng)藥,但隨著害蟲抗藥性的增加以及用藥對環(huán)境安全和人類健康的危害等問題的出現(xiàn)化學(xué)農(nóng)藥的安全性面臨著挑戰(zhàn),其有效性也由于大螟和二化螟幼蟲具有很好的隱蔽性成蟲是夜間活動的特點大大折扣,通過寄主植物揮發(fā)物調(diào)控螟蟲行為進行害蟲防治[4]應(yīng)運而生,成為一項新的研究領(lǐng)域。
糖蜜草(Melinis minutiflora P.Beauv)屬于禾本科(Poaceae)糖蜜草屬,它的莖和葉片上密生腺毛能分泌甜味粘液,具有香味。在非洲的肯尼亞地區(qū)糖蜜草被用作驅(qū)避植物間作于玉米田中防治班禾草螟(Chilo partellus)和玉米楷夜蛾(Busseola fusca)[5]取得了很大的經(jīng)濟效益。螟蟲行為驅(qū)性試驗證明間作于玉米田中糖蜜草的揮發(fā)物不僅能夠驅(qū)避雌蛾而且能夠增加寄生性天敵大螟盤絨繭蜂的寄生率[6,7],有效的減小了害蟲的危害并增加了作物的產(chǎn)量。室內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)該植物水蒸氣提取物對班禾草螟懷卵雌成蟲的產(chǎn)卵量為2.2(對照產(chǎn)卵量為40.9),田間試驗發(fā)現(xiàn)玉米單一種植蟲害率為39.2%,而間作糖蜜草后蟲害率降低到4.6%[6]。大螟和二化螟同玉米螟一樣都是鉆蛀性害蟲,對于該植物對以上兩種螟蟲是否具有驅(qū)避作用以及驅(qū)避作用成分的研究還未見報道。本研究通過固相微萃取技術(shù)采集糖蜜草的揮發(fā)物,然后利用GC-MS結(jié)合保留指數(shù)以及標(biāo)樣對照對揮發(fā)性成分進行分離鑒定,為下一步更好地利用糖蜜草揮發(fā)性成分驅(qū)避水稻螟蟲奠定基礎(chǔ),也為合理進行水稻種植提供理論依據(jù)。
GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司);手動固相微萃取(SPME)裝置(美國Supelco公司),萃取頭(Polyacrylate(PA)85 μm; polydimethylsiloxane(PDMS)100 μm;polydimethylsiloxane/divinybenzene(PDMS/DVB)65 μm);毛細管色譜柱Rtx-5MS(0.25 μm×30.0 m×0.25 mm)。
標(biāo)準(zhǔn)樣品芳樟醇(美國Alfa,97%)、壬醛(美國Alfa,98%)、別羅勒烯(日本TCI,>90%)、萘(上海)、水楊酸甲酯(上海,98%)、癸醛(美國Alfa,96%)、吲哚(上海)、α-雪松烯(Sigma,99%)、石竹烯(日本 TCI,>90%)、α-葎草烯(日本TCI,>93%),柏木腦(98%),正十四烷(Sigma-Aldrich,≥99%)和正十六烷(Sigma-Aldrich,≥98%)。C8~C40混標(biāo)(含植烷和姥鮫烷)購于上海西域公司(美國Accustandard)。
糖蜜草于2009年8月采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所試驗田。
2.1 樣品制備
取樣前先將試驗用三種萃取頭在氣相色譜進樣口老化0.5 h,老化溫度250℃。選取新鮮干凈的糖蜜草放入2 L的廣口瓶內(nèi),用封口膜封口后,置于45℃的水浴鍋內(nèi),將固相微萃取裝置的針頭穿透封口膜,插入瓶內(nèi)植物體上方,然后小心的推出纖維頭,同時用鐵架臺固定固相微萃取裝置的手柄,自萃取纖維頭推出后開始計時,待吸附完畢后(60 min)立即在GC-MS進樣口(250℃)解吸附(1 min)進行化學(xué)成分分析。各標(biāo)準(zhǔn)樣品氣質(zhì)分析采用氣相微量注射器(5 μL)頂空吸取樣品直接進樣(1 μL)。
2.2 GC-MS分析
色譜條件:色譜柱為Rtx-5MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)石英毛細管柱;載氣氦氣(99.999%);色譜柱起始溫度為40℃,保持2 min,然后以8℃/ min升溫至150℃,然后再以3℃/min升至250℃,恒溫5 min。不分流進樣。
質(zhì)譜條件:電離方式為EI源,電離能量70 eV;離子源溫度200℃;接口溫度250℃;質(zhì)量掃描范圍為m/z 45~500;譜圖檢索:采用 NIST08.L和NIST08s.L進行檢索。
2.3 KI測定
取正構(gòu)烷烴烷烴混標(biāo)(C8-C40)按照上述氣相色譜和質(zhì)譜條件進樣分析,測定各正構(gòu)烷烴的保留時間,再在完全相同的氣相色譜和質(zhì)譜條件下對采集的樣品進行分析,測定各組分的保留時間,根據(jù)下面公式計算出各組分的Kovats保留指數(shù)[8]。
式中KI樣品—樣品色譜峰的KI;KI前—樣品色譜峰前面烷烴標(biāo)樣的KI;Rt樣品—樣品色譜峰的Rt;Rt前—前面烷烴標(biāo)樣的Rt;Rt后—后面烷烴標(biāo)樣的Rt。
2.4 分析方法
在同一固相微萃取和GC-MS分析條件下,比較三種不同涂層的纖維頭所得到的總離子流色譜圖,選擇最佳色譜圖利用島津 QP2010所配備的NIST08.L和NIST08s.L自動檢索,選取質(zhì)譜匹配度高的前6種物質(zhì)的KI值,將質(zhì)譜匹配度和KI值匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)確定為該物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。無KI值匹配性和無文獻KI值可參照且質(zhì)譜匹配度低的成分均定為未知物質(zhì),未列于表中。部分化合物通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜圖和保留時間進行確認。單個化合物的相對百分含量用總峰面積歸一化后,用其峰面積的相對百分比來表示。
3.1 纖維頭的選擇
在其它條件恒定情況下,本實驗比較了通過三種不同涂層的纖維頭聚丙烯酸酯(PA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)所萃取的糖蜜草揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果如圖1所示,發(fā)現(xiàn)PDMS/DVB萃取頭對糖蜜草揮發(fā)性成分吸附能力最強,因此本實驗選用PDMS/DVB涂層纖維萃取頭。
3.2 糖蜜草揮發(fā)性成分分析
按上述試驗方法和條件對糖蜜草揮發(fā)性成分進行氣相色譜-質(zhì)譜分析,計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索得到相似度高的化合物,然后根據(jù)計算的保留指數(shù)值以及標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時間鑒定了33個化合物,按照峰面積歸一化法確定了各成分的相對含量,結(jié)果見表1。鑒定出的33個化合物占色譜總餾分出峰面積的90.94%,主要為烷烴(55.06%)以及單萜或倍半萜烯類(26.89%)化合物。鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異丁酯應(yīng)該是由于使用parafilm封口膜而引入的外源污染物。
圖1 PA、PDMS和PDMS/DVB三種纖維頭所吸附的揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of the volatile compounds by PA,PDMS and PDMS/DVB fibers
表1 糖蜜草主要揮發(fā)性成分及其相對含量Table 1 Composition of the volatile constituents from M.minutiflora
2 5 2 0.7 3 3 正十六烷H e x a d e c a n e 9 5 1 6 0 0 0.8 9 2 6 2 1.1 4 2 柏木腦C e d r o l 9 5 1 6 1 8 1.2 7 2 7 2 3.2 4 2 正十七烷H e p t a d e c a n e 9 8 1 7 0 0 1.1 3 2 8 2 3.3 9 2 降植烷N o r p h y t a n e 9 7 1 7 0 6 1.8 0 2 9 2 5.1 2 5 苯甲酸芐酯A s c a b i n 9 5 1 7 7 1 1.0 9 3 0 2 5.9 4 2 正十八烷O c t a d e c a n e 9 6 1 8 0 0 0.5 9 3 1 2 6.2 1 7 植烷P h y t a n e 9 7 1 8 3 0 1.1 1 3 2 2 7.9 0 8 鄰苯二甲酸二異丁酯I s o b u t y l p h t h a l a t e 9 8 1 8 7 8 1.5 8 3 3 3 0.5 8 3 鄰苯二甲酸二丁酯B u t y l p h t h a l a t e 9 8 1 9 6 5 0.3 2
糖蜜草在烏干達和肯尼亞等地已被應(yīng)用于Push-Pull害蟲防治策略,它對鉆蛀性害蟲驅(qū)避作用明顯[9]。Kimani等對該植物揮發(fā)性成分進行了GC和GC-MS分析,共鑒定了16個化合物[5],部分化合物與該研究得到化合物不同,這可能與揮發(fā)物的采集方法、分析條件以及植物生境的不同等因素有關(guān)。糖蜜草通過氣相色譜耦合觸角電位儀(GC-EAG)以及GC-MS分析發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性萜烯類成分(E)-ocimene、α-terpinolene、β-caryophyllene、humulene、(E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene、α-cedrene對玉米楷夜蛾(B.fusca)和班禾草螟(C.partellus)有電位反應(yīng)[10]。不同于前人采用的吸附劑吸附方法[5],本研究采用固相微萃取技術(shù)采集揮發(fā)物,分析鑒定出了更多的揮發(fā)性成分,對于它們對水稻螟蟲大螟和二化螟的行為反應(yīng)及其作用機制仍需進一步的探討。寄主植物通過植物揮發(fā)物與昆蟲發(fā)生化學(xué)聯(lián)系,它能調(diào)節(jié)害蟲的行為反應(yīng)使其處在利于自身生長發(fā)育的生境條件下,這些揮發(fā)物為人類提供安全、無公害的防蟲治蟲新途徑,也必將在未來的綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。
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Analysis of Volatile Compounds from Melinis minutiflora by HS-SPME-GC-MS
GAO Guang-chun,ZHENG Xu-song,XU Hong-xing,LV Zhong-xian*
Institute of Plant Protection and Microbiology,Zhejiang Academy of Agriculture Science,Hangzhou 310021,China
In this study,a head-space solid phase microextraction(HS-SPME)method was developed for extracting the volatile compounds from Melinis minutiflora.Then gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)coupled with retention indicator and comparison with standard samples was used to characterize the components of the volatile compounds.Then the relative proportion of each component was calculated by the peak area normalization method.The results showed that Polydimethylsiloxane/divinybenzene(PDMS/DVB)SPME fibers based on the number of peaks performed well for extracting volatile compounds from M.minutiflora.Thirty-three compounds were obtained which accounted for 90.94%of the total peak areas with alkanes and terpenes as the dominant components.This study lays the foundation for developing M.minutiflora as the repellent plant for rice stem borer in terms of effective pest prevention.Also,it is the ground work for applying the evading volatiles to the rice field.
Melinis minutiflora;SPME;GC-MS;volatile constituents
1001-6880(2011)06-1073-04
2010-02-23 接受日期:2010-06-13
農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項;水稻螟蟲防治技術(shù)研究(200803004);浙江省優(yōu)先主題:稻田農(nóng)藥減量增效安全使用關(guān)鍵技術(shù)(2008C1207-2)
*通訊作者 E-mail:luzxmh2004@yahoo.com.cn
S345.1;Q946.91
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