牛奶菜中黃酮類成分的研究

胡 慧，吳意軒，何祥久

武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢430072

牛奶菜中黃酮類成分的研究

胡 慧，吳意軒，何祥久*

武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢430072

從牛奶菜(Marsdenia sinensis Hemsl)根中分離得到6個(gè)黃酮類化合物，經(jīng)光譜分析確定其結(jié)構(gòu)為:芹菜素(1)，(2S)-柚皮素(2)，木犀草素(3)，異牡荊素(4)，8-C-β-D-Glucopyranosyl apigeninidin(5)，5，7-二羥基色原酮(6)。所有化合物均為首次從該植物中分離得到，同時(shí)對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，化合物1～5均表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。

牛奶菜;活性成分;細(xì)胞毒活性

牛奶菜(Marsdenia sinensis Hemsl)為蘿藦科牛奶菜屬植物，分布在我國浙江、江西、湖北、湖南、福建、廣東、廣西、四川等地區(qū)。全株能壯筋骨、健骨利腸;根能舒經(jīng)活絡(luò)行氣止痛;果實(shí)能止咳定喘［1］。其化學(xué)成分的研究較少，目前報(bào)道主要有三萜類化合物［2，3］。為了進(jìn)一步探索其活性成分，我們對(duì)牛奶菜根進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從中分得了6個(gè)黃酮類化合物，根據(jù)理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，分別鑒定為芹菜素(apigenin，1)，(2S)-柚皮素(naringenin，2)，木犀草素(luteolin，3)，異牡荊素(isovitexin，4)，8-C-β-D-glucopyranosyl apigeninidin(5)和5，7-二羥基色原酮(5，7-dihydroxychromone，6)。這6個(gè)化合物均首次從該植物中分離得到。

1 儀器和材料

Bruker AV-400型核磁共振光譜儀;Bruker Esquire 2000型質(zhì)譜儀;半制備HPLC:島津LC-9A高效液相色譜儀，配備Shimadzu SPD-6AV型檢測(cè)器，Shimadzu CTO-6A型柱溫箱;RE 52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。Sephadex LH-20(Pharmacia公司);ODS(Pharmacia公司);D-101大孔吸附樹脂(西安藍(lán)曉科技有限公司);柱層析用硅膠(100～200目、200～300目)和薄層色譜硅膠GF254均為青島海洋化工廠生產(chǎn)。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

ALB-124電子天平(Acculab Sartius Group);低速離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠);CHS-213生物倒置顯微鏡(日本Olympus公司);超凈工作臺(tái)(蘇州實(shí)驗(yàn)儀器廠);TC2323型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司);全自動(dòng)立式高壓消毒鍋(武漢國光醫(yī)療儀器廠);微量加樣器(Gilson公司產(chǎn)品)。

人肝癌細(xì)胞株HepG2、人白血病細(xì)胞株(HL-60及Mata)購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心;高糖DMEM培養(yǎng)粉(Sigma公司產(chǎn)品);胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品);胰蛋白酶(武漢科瑞生物技術(shù)公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司產(chǎn)品);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司產(chǎn)品)。

牛奶菜根購自安徽亳州，經(jīng)武漢大學(xué)藥學(xué)院何祥久教授鑒定為Marsdenia sinensis。

2 提取與分離

8 kg牛奶菜根用70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，提取液合并減壓濃縮得浸膏。將浸膏分散于蒸餾水中，依次以氯仿及水飽和的正丁醇萃取，回收溶劑后得到氯仿部位浸膏85 g，正丁醇部位浸膏152 g。

氯仿部位進(jìn)行硅膠柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯(50∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1)，合并洗脫液為15部分。第13部分經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-甲醇(100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，0∶1)洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以氯仿-甲醇(7∶3)洗脫，得到化合物1(103.2 mg)。第12部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱、Sephadex LH-20及制備HPLC分離純化得到化合物6(10.5 mg)。正丁醇部位經(jīng)D-101大孔樹脂吸附，以水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇和丙酮梯度洗脫，得到7個(gè)部分。70%乙醇部分經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-甲醇(50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，0∶1)梯度洗脫，得到14個(gè)部分，第3部分(0.23 g)經(jīng)硅膠柱層析，以環(huán)己烷-乙酸乙酯為洗脫劑，得到化合物2(16.7 mg)。第6部分經(jīng)反復(fù)開放和中低壓ODS柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，得到化合物3(51.1 mg)。大孔樹脂30%乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-甲醇梯度洗脫，得到化合物5(15.5 mg)和4(23.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:6.19(1H，d，J=0.9 Hz，H-6)，6.48(1H，d，J=0.9 Hz，H-8)，6.78(1H，s，H-3)，6.93(2H，d，J=8.6 Hz，H-3'，5')，7.93(2H，d，J=8.6 Hz，H-2'，6')，10.57(2H，brs，7，4'-OH)，12.97(1H，s，5-OH)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:164.2(s，C-2)，102.8(d，C-3)，181.7(s，C-4)，157.3(s，C-5)，98.8(d，C-6)，163.7(s，C-7)，93.9(d，C-8)，161.4 (s，C-9)，103.6(s，C-10)，121.1(s，C-1')，128.4(d，C-2')，115.9(d，C-3')，161.1(s，C-4')，115.9(d，C-5')，128.4(d，C-6')。從NMR數(shù)據(jù)可以看出化合物1為黃酮類化合物，1H NMR顯示B環(huán)為4'-羥基取代，A環(huán)有2個(gè)酚羥基取代。其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報(bào)道的芹菜素?cái)?shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為芹菜素(5，7，4'-三羥基黃酮，apigenin)。

化合物2 白色粉末，1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)δ:12.21(1H，s，5-OH)，9.70(1H，s，OH)，8.60(1H，s，OH)，7.41(2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，6.91(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，5.97(1H，d，J=1.6 Hz，H-6)，5.96(1H，d，J=1.6 Hz，H-8)，5.48(1H，dd，J=13.0，3.0 Hz，H-2)，3.16(1H，dd，J =13.0，17.1 Hz，H-3a)，2.71(1H，dd，J=17.1，3.0 Hz，H-3b)。13C NMR(100 MHz，Acetone-d6)δ:80.3 (d，C-2)，43.9(t，C-3)，197.6(s，C-4)，165.7(s，C-5)，97.2(d，C-6)，167.7(s，C-7)，96.2(d，C-8)，164.8(s，C-9)，103.6(s，C-10)，131.2(s，C-1')，129.4(d，C-2')，116.6(d，C-3')，159.1(s，C-4')，116.6(d，C-5')，129.4(d，C-6')。從NMR可以看出化合物2為黃酮類化合物，1H NMR顯示B環(huán)為4'-羥基取代(δ 6.91，3'，5'-H;δ7.41，2'，6'-H)，另外A環(huán)還含有2個(gè)酚羥基取代。根據(jù)H-2和H-3的化學(xué)位移及偶合常數(shù)，確定C-2為S構(gòu)型，提示此化合物為二氫黃酮。其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5，6］報(bào)道的(2S)-柚皮素?cái)?shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為(2S)-柚皮素(naringenin)。

化合物3 黃色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.99(1H，s，5-OH)，7.42(1H，dd，J= 2.2，8.2 Hz，H-6')，7.41(1H，d，J=2.2 Hz，H-2')，6.90(1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.68(1H，s，H-3)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:163.9 (s，C-2)，102.9(d，C-3)，181.7(s，C-4)，161.5(s，C-5)，98.9(d，C-6)，164.2(s，C-7)，93.9(d，C-8)，157.3(s，C-9)，103.7(s，C-10)，121.5(s，C-1')，113.4(d，C-2')，145.8(s，C-3')，149.7(s，C-4')，116.0(d，C-5')，119.0(d，C-6')。從NMR可以看出化合物3為黃酮類化合物，其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的木犀草素?cái)?shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為木犀草素(luteolin)。

化合物4 黃色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:13.56(1H，s，H-5)，10.46(2H，br s，H-4'，7)，7.92(2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.92(2H，d，J =8.8 Hz，H-3'，5')，6.79(1H，s，H-3)，6.51(1H，s，H-8)，4.57(1H，d，J=9.8 Hz，H-1'')，4.04(1H，t，J =9.8 Hz，H-2'')，3.11～3.21(3H，m，H-3''，H-4''，H-5'')，3.39(1H，m，H-6'')，3.67(1H，d，J=11.1 Hz，H-6'')。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:163.5 (s，C-2)，102.8(d，C-3)，181.9(s，C-4)，156.2(s，C-5)，108.9(s，C-6)，163.5(s，C-7)，93.7(d，C-8)， 161.2(s，C-9)，103.4(s，C-10)，121.1(s，C-1')，128.4(d，C-2')，116.0(d，C-3')，160.6(s，C-4')，116.0(d，C-5')，128.4(d，C-6')，73.1(d，C-1'')，70.6(d，C-2'')，78.9(d，C-3'')，70.2(d，C-4'')，81.5(d，C-5'')，61.5(t，C-6'')。由NMR可以看出化合物4為黃酮苷類化合物，7.92(H-2'，6')，6.92 (H-3'，5')為B環(huán)上的AA'BB'偶合系統(tǒng)，4'位有羥基取代。13C NMR中δ 78.9、73.1、70.6、70.2、81.5和61.5六個(gè)信號(hào)為β-葡萄糖的信號(hào)，結(jié)合HMBC譜可以確定此葡萄糖與黃酮C-6位為C-C連接。其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的異牡荊素(isovitexin)數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為異牡荊素(isovitexin)。

化合物5 黃色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:13.18(1H，s，5-OH)，10.42(2H，br s，H-4'，7)，6.79(1H，s，H-3)，6.27(1H，s，H-6)，8.03 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，4.68(1H，d，J=10.0 Hz，H-1'')，3.82(1H，m，H-2'')，3.25(1H，m，H-3'')，3.35(1H，m，H-4'')，3.28(1H，m，H-5'')，3.77(2H，m，H-6'')。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:164.0(s，C-2)，102.4(d，C-3)，182.1(s，C-4)，160.4(s，C-5)，98.1(d，C-6)，162.5(s，C-7)，104.6(s，C-8)，156.0 (s，C-9)，104.0(s，C-10)，121.6(s，C-1')，129.0(d，C-2')，115.8(d，C-3')，161.1(s，C-4')，115.8(d，C-5')，129.0(d，C-6')，73.3(d，C-1'')，70.8(d，C-2'')，78.7(d，C-3'')，70.6(d，C-4'')，81.8(d，C-5'')，61.2(t，C-6'')。由1H和13C NMR可以看出化合物5為一黃酮苷類化合物，δ 8.03(H-2'，6')和δ 6.88(H-3'，5')為B環(huán)上的AA'BB'偶合系統(tǒng)，可以確定 B環(huán)為 4'單取代苯環(huán)，δ 13.18為 5-OH，δ 10.42為一寬峰(2H，7-OH，4'-OH)。13C NMR中δ 73.3、70.8、78.7、70.6、81.8和61.2六個(gè)信號(hào)為β-葡萄糖的信號(hào)，與化合物4的13C NMR譜比較，可以確定此葡萄糖與黃酮C-8位C-C鍵連接。結(jié)合文獻(xiàn)［9］可以確定化合物 5為 8-C-β-D-glucopyranosyl apigeninidin。

化合物6 黃色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.69(1H，s)，8.15(1H，d，J=6.0 Hz，H-2)，6.24(1H，d，J=6.0 Hz，H-3)，6.15(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.31(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:157.3(d，C-2)，110.4 (d，C-3)，181.1(s，C-4)，161.6(s，C-5)，99.3(d，C-6)，165.6(s，C-7)，94.2(d，C-8)，157.9(s，C-9)，104.5(s，C-10)。在1H NMR中，在δ 8.15(1H，d，J =6.0 Hz)氫信號(hào)和δ 6.24(1H，d，J=6.0 Hz)處的氫信號(hào)形成AB自旋偶合系統(tǒng)，δ 6.31(1H，d，J= 2.0 Hz)氫信號(hào)和δ 6.15(1H，d，J=2.0 Hz)氫信號(hào)分別為色原酮8位和6位AX自旋偶合系統(tǒng)的兩個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)。δ 12.69(1H，s)信號(hào)為5位羥基質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合文獻(xiàn)［10］可以確定化合物6為5，7-二羥基色原酮(5，7-dihydroxychromone)。

4 活性測(cè)試結(jié)果

采用MTT法測(cè)定所得化合物的抗腫瘤活性，用Calclusyn軟件計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)?；钚詼y(cè)試結(jié)果見表1。

表1 化合物的抗腫瘤IC50值Table 1 IC50values of antiproliferative activity of the compounds isolated from M.sinensis

活性測(cè)試結(jié)果表明，部分單體化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性?；衔?、2和3對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用較為明顯。化合物4和5對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，而對(duì)HepG2細(xì)胞無明顯抑制作用。所測(cè)試化合物對(duì)Mata細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抑制作用。

牛奶菜同屬植物烏骨藤的制劑具有較好的抗癌作用，已經(jīng)廣泛用于臨床。我們前期研究表明，牛奶菜提取物具有較好的抑制癌細(xì)胞增殖作用。從牛奶菜中分離得到的黃酮類化合物顯示出一定的抗癌作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了牛奶菜的潛在抗癌作用，這些化合物的抗癌作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

致謝:感謝武漢大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心邱國福老師代測(cè)所有核磁共振波譜。

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Flavonoids from the Roots of Marsdenia sinensis Hemsl

HU Hui，WU Yi-xuan，HE Xiang-jiu*
College of Pharmacy，Wuhan University，Wuhan 430072，China

Six flavonoids were isolated from the roots of Marsdenia sinensis Hemsl.Their structures were identified by spectroscopic analysis as apigenin(1)，naringenin(2)，luteolin(3)，isovitexin(4)，8-C-β-D-glucopyranosyl apigeninidin(5)，and 5，7-dihydroxychromone(6).All these compounds were obtained from the plant for the first time，and their cytotoxicities were evaluated.Compounds 1-5 had relatively high cytotoxicities.

Marsdenia sinensis Hemsl;active constituents;cytotoxicities

1001-6880(2011)06-1045-04

2010-05-26 接受日期:2010-07-07

留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目

*通訊作者 Tel:86-27-68759923;E-mail:hexiangjiu@whu.edu.cn

R284.1

A