白細(xì)胞介素21及白細(xì)胞介素12單用或聯(lián)合應(yīng)用對子宮內(nèi)膜癌患者外周血單核細(xì)胞抗腫瘤活性的影響

田永菊，崔保霞，馬道新，張 妍,3，侯 菲，張文靜

山東大學(xué) 齊魯醫(yī)院 1婦產(chǎn)科 2血液病研究室，濟南 2500123山東省濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濰坊 261041

·論著·

白細(xì)胞介素21及白細(xì)胞介素12單用或聯(lián)合應(yīng)用對子宮內(nèi)膜癌
患者外周血單核細(xì)胞抗腫瘤活性的影響

田永菊1，崔保霞1，馬道新2，張 妍1,3，侯 菲1，張文靜1

山東大學(xué) 齊魯醫(yī)院1婦產(chǎn)科2血液病研究室，濟南 250012
3山東省濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濰坊 261041

目的觀察白細(xì)胞介素(IL)21及IL12單用或聯(lián)合應(yīng)用對子宮內(nèi)膜癌患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)抗腫瘤活性的影響。方法體外分離子宮內(nèi)膜癌患者外周血中的PBMCs，用低濃度IL2維持培養(yǎng)，經(jīng)不同的刺激條件(對照組、抗IL21組、IL21組、IL12組和IL21+IL12聯(lián)合組)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測PBMCs 的細(xì)胞毒活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+FOXP3+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Treg細(xì)胞)和CD4+IL17A+T輔助17細(xì)胞(Th17細(xì)胞)的含量，細(xì)胞活性檢測試劑-8(CCK-8)法檢測PBMCs的增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMCs的凋亡情況。結(jié)果與對照組相比，IL21及IL12可顯著增強PBMCs細(xì)胞毒活性，IL21+IL12聯(lián)合組的效果優(yōu)于單用IL21組和IL12組。IL21及IL12可顯著降低Treg細(xì)胞含量，抑制PBMCs凋亡。不同細(xì)胞因子處理組對Th17細(xì)胞的含量和PBMCs的增殖能力均無顯著影響。結(jié)論IL21及IL12可增強子宮內(nèi)膜癌患者PBMCs的細(xì)胞毒活性，聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯。抑制Treg細(xì)胞的分化和PBMCs的凋亡可能為其機制之一，而與Th17細(xì)胞的分化無關(guān)。

細(xì)胞因子；外周血單核細(xì)胞；細(xì)胞毒活性；Treg細(xì)胞；Th17細(xì)胞

在腫瘤形成過程中，腫瘤細(xì)胞可通過多種途徑逃離免疫細(xì)胞的清除，包括自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能喪失、Treg細(xì)胞的免疫抑制等[1-2]。近來研究發(fā)現(xiàn)，機體存在兩種不同于傳統(tǒng)Th1和Th2細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞—Treg和Th17細(xì)胞。Treg細(xì)胞是一群免疫抑制性T細(xì)胞，可維持機體的自身免疫耐受，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供逃逸免疫攻擊的優(yōu)勢環(huán)境[3]。研究證實，多種惡性腫瘤外周血和腫瘤組織中Treg細(xì)胞數(shù)量增多[4-5]。Th17細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素(interleukin，IL)17A、IL17F和IL6，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與多種自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的發(fā)病過程，但Th17細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答中的表達及其所起的作用仍有很多爭議[6-7]。有研究顯示，IL21和IL12在多種惡性腫瘤中發(fā)揮了強有力的抗腫瘤作用[8-10]，但二者對子宮內(nèi)膜癌患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的抗腫瘤活性作用卻鮮見報道。本研究在體外分離了子宮內(nèi)膜癌患者的PBMCs， 觀察了IL21及IL12單用或聯(lián)合應(yīng)用對子宮內(nèi)膜癌患者PBMCs抗腫瘤活性的影響，并初步探討了其機制，以期在臨床上為子宮內(nèi)膜癌患者制訂出更有效的免疫治療方案提供理論依據(jù)。

材料和方法

試劑和儀器人重組細(xì)胞因子IL2、IL21、IL12和兔抗人IL21抗體(美國Peprotech公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Thermo公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，上海Fumeng Gene公司)，青鏈霉素混合液(100×，北京Solarbio Science & Technology公司)，淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，相對密度1.077，天津TBD公司)，人Treg細(xì)胞抗體(FITC- CD4、APC- CD25、PE- FOXP3)、人Th17細(xì)胞抗體(PE-Cy5- CD3、FITC- CD8、PE- IL17A)(美國eBioscience公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristic acetate, PMA)、離子霉素及莫能霉素(美國Alexis公司)，細(xì)胞活性檢測試劑-8(cell counting kit-8, CCK-8)(南京凱基公司)，Annexin V-FITC Kit(美國Invitrogen公司)，LDH Cytotoxicity Kit (美國BioVision公司)。Iishikawa細(xì)胞株由本實驗室常規(guī)保存。酶標(biāo)儀(BIO-RAD, Model 680)、流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)購自美國BD公司。

標(biāo)本來源收集2010年3月至7月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診的子宮內(nèi)膜癌患者外周血標(biāo)本14例，經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷，其中，腺癌Ⅰa期6例，Ⅰb期4例，Ⅰc期1例，Ⅱa期1例，Ⅲ期1例，透明細(xì)胞癌Ⅳ期1例，實驗進行前患者未行任何抗腫瘤治療?；颊咂骄挲g為(57.5±6.0)歲(44～66歲)，近期內(nèi)均無急慢性感染，無人類免疫缺陷病毒感染，無梅毒及病毒性肝炎，無自身免疫性疾病等病史。

Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液為RPMI 1640，含10%FBS、100×青霉素和鏈霉素混合液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行實驗。

PBMCs的分離和培養(yǎng)將子宮內(nèi)膜癌患者外周血用Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMCs，1%臺盼藍染色檢測細(xì)胞活力(>95%)并計數(shù)。將細(xì)胞懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)液(含20%FBS、100×青鏈霉素混合液和5 ng/ml IL2)，分5組培養(yǎng)，包括：對照組、抗IL21 (2 μg/ml)組、IL21 (50 ng/ml)組、IL12(5 ng/ml)組和聯(lián)合組[IL21(50 ng/ml)+IL12(5 ng/ml)]。將5組細(xì)胞分別接種于6孔板(5×106個細(xì)胞/孔，用于細(xì)胞表型和細(xì)胞毒性檢測)和96孔板(1×104個細(xì)胞/孔，設(shè)3個復(fù)孔，用于增殖檢測)中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用于下述實驗。

乳酸脫氫酶釋放法檢測PBMCs的細(xì)胞毒活性效應(yīng)細(xì)胞為5組經(jīng)細(xì)胞因子處理72 h的PBMCs，靶細(xì)胞為Ishikawa細(xì)胞，效靶比為100∶1，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放法檢測細(xì)胞毒活性。具體步驟參照LDH Cytotoxicity Kit說明書。用酶標(biāo)儀以490nm波長測定各孔A值,按以下公式計算細(xì)胞毒活性：細(xì)胞毒活性(%)=(效靶細(xì)胞混合釋放組A值-低釋放組A值)/(最大釋放組A值-低釋放組A值)×100%

流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞培養(yǎng)的PBMCs經(jīng)細(xì)胞因子處理72h后，每組收集1×106個細(xì)胞，充分洗滌、重懸，Treg細(xì)胞染色時首先用相應(yīng)抗體進行細(xì)胞膜表型染色，然后用Fix/Perm固定和破膜，最后進行胞內(nèi)抗體染色。Th17細(xì)胞染色時先用25 ng/ml乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristic acetate，PMA)、1 μg/ml離子霉素和1.7 μg/ml莫能霉素，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4.5 h，其他步驟同上。用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)CS Express V3軟件分析數(shù)據(jù)。

CCK-8法檢測PBMCs的增殖96孔板中的5組PBMCs經(jīng)細(xì)胞因子處理72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，同時設(shè)置空白對照組，每組3個復(fù)孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀以450 nm波長檢測各孔A值。A值反映細(xì)胞增殖程度。

流式細(xì)胞術(shù)分析PBMCs的凋亡從凋亡早期分析細(xì)胞凋亡。收集5組經(jīng)細(xì)胞因子處理72 h的PBMCs約1×105個，進行細(xì)胞凋亡檢測，具體步驟參照Annexin V-FITC Kit說明書。用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)CS Express V3軟件分析數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

細(xì)胞因子處理后PBMCs細(xì)胞毒活性的比較IL21組[(64.50±7.08)%]、IL12組[(49.35±3.40)%]和IL21+IL12聯(lián)合組[(74.27±3.46)%]PBMCs對Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯高于對照組[(43.89±3.73)%](P均<0.01)。使用抗IL21抗體[(40.21±3.62)%]中和IL21的生物活性后，PBMCs細(xì)胞毒活性明顯下降(P<0.05)。IL21+IL12聯(lián)合組PBMCs細(xì)胞毒活性均明顯高于IL21組和IL12組(P均<0.01)。

Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的檢測結(jié)果與對照組[(5.86±1.04)%]相比，IL21組[(3.96±0.50)%]、IL12組[(3.98±0.60)%]和IL21+IL12聯(lián)合組[(3.83±0.59)%]Treg細(xì)胞的含量均顯著降低(P均<0.01)。使用抗IL21[(7.16±1.26)%] 中和IL21的生物活性后，Treg細(xì)胞的含量顯著升高(P<0.05)。IL21+IL12聯(lián)合組與IL21組和IL12組相比，Treg細(xì)胞的含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(圖 1)。

對照組、抗IL21組、IL21組、IL12組和IL21+IL12聯(lián)合組的Th17細(xì)胞含量分別為(0.31±0.16)%、(0.25±0.12)%、(0.39±0.30)%、(0.17±0.07)%和(0.21±0.08)%，與對照組相比，各細(xì)胞因子處理組對Th17細(xì)胞的含量均無顯著影響(P均>0.05)(圖 2)。

細(xì)胞因子處理后PBMCs增殖能力的比較與對照組相比，抗IL21組、IL21組、IL12組和IL21+IL12聯(lián)合組對PBMCs的增殖能力均無顯著影響；IL21+IL12聯(lián)合組分別與IL21組和IL12組相比，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

細(xì)胞因子處理后PBMCs凋亡情況的分析PBMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，IL21組[(7.80±0.36)%]、IL12組[(8.05±1.08)%] (P均<0.01)和IL21+IL12聯(lián)合組[(7.41±1.29)%] (P<0.05)凋亡率均較對照組[(11.13±1.33)%]明顯下降。使用抗IL21抗體[(13.94±1.55)%] 中和IL21的生物活性后，PBMCs凋亡率明顯上升(P<0.05)。IL21+IL12聯(lián)合組分別與IL21組和IL12組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(圖 3)。

討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，在傳統(tǒng)的三大治療措施手術(shù)、化療和放療的基礎(chǔ)上，其治療綜合水平日益提高，但從總體上，子宮內(nèi)膜癌術(shù)后轉(zhuǎn)移、 復(fù)發(fā)仍是一個亟待解決的難題。近年研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞在腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中均增多，并以獨特的免疫抑制作用影響機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。降低Treg細(xì)胞的數(shù)量，可打破機體的免疫耐受狀態(tài)，增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。Th17細(xì)胞可特異性地分泌IL17，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的發(fā)生發(fā)展，但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用仍有很多爭議。近年來，生物治療中的細(xì)胞因子免疫治療因其影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，受到越來越多的關(guān)注。目前 IL21和IL12等正在進行臨床試驗，但其是否影響子宮內(nèi)膜癌患者PBMCs的抗腫瘤活性尚不明確。

A～E圖右上限為Treg細(xì)胞，各象限內(nèi)的百分?jǐn)?shù)代表Treg細(xì)胞的含量，此流式圖為14例子宮內(nèi)膜癌患者中1例的實驗結(jié)果，具有代表性The upper-right quadrant of A-E group represents Treg cells and the numbers with the dot plots represent the percentages of Treg cells, this chart reflects a typical case among these 14 patients with endometrial cancerA.對照組；B.抗IL21組；C.IL21組；D.IL12組；E. IL21+IL12聯(lián)合組 A.control group; B.anti-IL21 group; C.IL21 group; D: IL12 group; E: combined group

A～E圖左上限為Th17細(xì)胞，各象限內(nèi)的百分?jǐn)?shù)代表Th17細(xì)胞的含量，此流式圖為14例子宮內(nèi)膜癌患者中1例的實驗結(jié)果，具有代表性The upper-left quadrant of A-E group represents Th17 cells and the numbers with the dot plots represent the percentages of Th17 cells, this chart reflects a typical case among these 14 patients with endometrial cancerA.對照組；B.抗IL21組；C.IL21組；D.IL12組；E.IL21+IL12聯(lián)合組 A.control group; B: anti-IL21 group; C.IL21 group; D.IL12 group; E.combined group

A～E圖右下限為凋亡細(xì)胞，各象限內(nèi)的百分?jǐn)?shù)代表凋亡細(xì)胞的含量，此流式圖為14例子宮內(nèi)膜癌患者中1例的實驗結(jié)果，具有代表性The lower-right quadrant of A-E group represents the apoptotic cells and the numbers with the dot plots represent the percentages of apoptosis cells, this chart reflects a typical case among these 14 patients with endometrial cancerA.對照組；B.抗IL21組；C.IL21組；D.IL12組；E.IL21+IL12聯(lián)合組 A.control group; B: anti-IL21 group; C.IL21 group; D.IL12 group; E.combined group

IL21是一種新型免疫刺激因子，能增強NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，抑制Treg細(xì)胞的免疫抑制作用等[11-13]。此外，IL21可上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達，是靜息和活化T細(xì)胞的生存因子[14]。目前IL21已在腎細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤和非霍奇金淋巴瘤等患者中進行了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗[10]，表現(xiàn)出了有效的抗腫瘤效能和安全性。本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者PBMCs在低濃度IL2維持培養(yǎng)下細(xì)胞毒活性很低，使用抗IL21抗體中和培養(yǎng)體系中IL21的生物活性后，細(xì)胞毒活性顯著降低。當(dāng)加入IL21后，細(xì)胞毒活性顯著增強，進一步研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)量顯著減少，PBMCs的凋亡顯著受抑制。Monteleone等[15]研究認(rèn)為，L21可與轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)一起誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化。本研究中，子宮內(nèi)膜癌PBMCs經(jīng)低濃度IL2維持培養(yǎng)和IL21誘導(dǎo)培養(yǎng)72h后，Th17細(xì)胞的含量無明顯增加，說明IL21增強PBMCs的抗腫瘤作用可能與Th17細(xì)胞無關(guān)。

IL12是一種具有多種生物活性的免疫調(diào)節(jié)因子，可增強NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等分泌[16]，并通過誘導(dǎo)IFN-γ的分泌和抑制IL2的表達來抑制Treg的增殖和活性[17]。目前IL12已在卵巢癌、宮頸癌、原發(fā)性腹膜癌、惡性黑色素瘤等患者中進行了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，其顯著的抗腫瘤作用引起廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，IL12能增強PBMCs的細(xì)胞毒活性，可能機制為降低Treg細(xì)胞的數(shù)量和抑制PBMCs的凋亡，從而誘導(dǎo)PBMCs的抗腫瘤活性。雖然有研究表明IL12可抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[18]，但在本研究中，子宮內(nèi)膜癌患者PBMCs經(jīng)IL12誘導(dǎo)培養(yǎng)后，Th17細(xì)胞的含量無明顯下降，提示IL12增強PBMCs的抗腫瘤作用可能與Th17細(xì)胞無關(guān)。

惡性腫瘤具有多種逃避腫瘤治療的機制，為了根除腫瘤和避免腫瘤再生，需要通過各種不同途徑同時攻擊腫瘤，大多數(shù)情況下選擇聯(lián)合用藥。臨床試驗已證實，細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用不僅能夠提高療效，而且能降低大劑量單因子應(yīng)用產(chǎn)生的毒副作用。IL21和IL12均能增強CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，同時IL21可促進穿孔素和粒酶B的分泌，而IL12可誘導(dǎo)IFN-γ的分泌，因此推測IL21和IL12聯(lián)合應(yīng)用方案可能更優(yōu)越。本研究證實在子宮內(nèi)膜癌PBMCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，IL21聯(lián)合IL12比單用IL21和IL12更能顯著增強PBMCs的細(xì)胞毒活性，從而進一步提高PBMCs的抗腫瘤活性。

最近研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞能抑制T細(xì)胞的增殖。Peluso等[19]證實IL21能促進T細(xì)胞的增殖，但不能抵抗Treg細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)。而Comes等[20]和Li等[12]發(fā)現(xiàn)IL21能部分逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的免疫抑制作用，當(dāng)其濃度達到200ng/ml時可完全阻斷Treg細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者的PBMCs經(jīng)IL21(50 ng/ml)及IL12(5 ng/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)72h后，其增殖均無顯著變化，推測其原因可能是誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中Treg細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)未完全消失或存在其他抑制因子，提示若進行腫瘤的細(xì)胞因子免疫治療時，如何提高細(xì)胞毒T細(xì)胞的增殖需要進一步的研究。

綜上，IL21和IL12可通過抑制Treg細(xì)胞的分化和PBMCs的凋亡，增強PBMCs的細(xì)胞毒活性，而且IL21聯(lián)合IL12能進一步增強PBMCs的細(xì)胞毒活性，從而更有效地提高PBMCs的抗腫瘤活性。本研究也發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者PBMCs的抗腫瘤活性與Th17細(xì)胞無關(guān)。本研究為子宮內(nèi)膜癌的免疫治療提供了依據(jù)，但IL21聯(lián)合IL12還需在臨床試驗中進一步驗證其安全性和有效性。

[1] Jordanova ES, Gorter A, Ayachi O, et al. Human Leukocyte Antigen Class Ⅰ, MHC class Ⅰchain-related molecule A, and CD8+/Regulatory T-Cell Ratio: Which Variable Determine Survival of Cervical Cancer Patients [J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(7):2028-2035.

[2] Watanabe M, Kono K, Kawaguchi Y, et al. Interleukin-21 can efficiently restore impaired antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in patients with oesophageal squamous cell carcinoma [J]. Br J Cancer, 2010, 102(3)：520-529.

[3] Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses [J]. Annu Rev Immunol, 2004, 22:531-562.

[4] Liyanage UK, Moore TT, Joo HG, et al. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma [J]. J Immunol, 2002, 169(5):2756-2761.

[5] Cureil TJ, Coukos G, Zou L, et a1. Specific recruitment of regulator T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival [J]. Nat Med，2004, 10(9):942-949.

[6] Miyahara Y, Odunsi K, Chen W, et al. Generation and regulation of human CD4+ IL-17-producing T cells in ovarian cancer [J]. Proc Natl Acad Sci, 2008, 105(40):15505-15510.

[7] Horlock C, Stott B, Dyson PJ, et al. The effects of trastuzumab on the CD4+ CD25+ FOXP3+ and CD4+ IL17A+ T-cell axis in patients with breast cancer [J]. Br J Cancer, 2009, 100(7):1061-1067.

[8] Indrová M, Bieblová J, Rossowska J, et al. HPV 16-associated tumors: IL-12 can repair the absence of cytotoxic and proliferative responses of tumor infiltrating cells after chemotherapy [J]. Int J Oncol, 2009, 34(1):173-179.

[9] Wolf AM, Rumpold H, Reimer D, et al. High IL-12 p35 and IL-23 p19 mRNA expression is associated with superior outcome in ovarian cancer [J]. Gynecol Oncol, 2010, 118(3):244-250.

[10] Hashmi MH, Van Veldhuizen PJ. Interleukin-21: updated review of Phase I and Ⅱ clinical trials in metastatic renal cell carcinoma, metastatic melanoma and relapsed/refractory indolent non-Hodgkin’s lymphoma [J]. Expert Opin Biol Ther, 2010, 10(5):807-817.

[11] Skak K, Kragh M, Hausman D, et al. Interleukin 21: combination strategies for cancer therapy [J]. Nat Rev Drug Discov, 2008, 7(3):231-240.

[12] Li Y, Yee C. IL-21-mediated Foxp3 suppression leads to enhanced generation of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes [J]. Blood, 2008, 111(1):229-235.

[13] Skak K, Frederiksen KS, Lundsgaard D. Interleukin-21 activates human natural killer cells and modulates their surface receptor expression [J]. Immunology, 2008, 123(4):575-583.

[14] Ostiguy V, Allard EL, Marquis M, et al. IL21 promotes T lymphocyte survival by activating the phosphatidylinositol-3 kinase signaling cascade [J]. J Leukoc Biol, 2007, 82(3):645-656.

[15] Monteleone G, Pallone F, MacDonald TT. Interleukin-21: a critical regulatory of the balance between effector and regulatory T-cell responses [J]. Trends Immunol, 2008, 29(6):290-294.

[16] Del Vecchio M, Bajetta E, Canova S, et al. Interleukin-12: biological properties and clinical application [J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(16):4677-4685.

[17] Cao X, Leonard K, Collins LI, et al. Interleukin 12 stimulates IFN-gamma-mediated inhibition of tumor-induced regulatory T-cell proliferation and enhances tumor clearance [J]. Cancer Res, 2009, 69(22):8700-8709.

[18] 黃俊，趙晶晶，李劍，等. IL12對BALB/C小鼠Th17細(xì)胞的分化的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009, 25(6)：490-492.

[19] Peluso I, Fantini MC, Fina D, et al. IL-21 counteracts the regulatory T cell-mediated suppression of human CD4+ T lymphocytes [J]. J Immunol, 2007, 178(2):732-739.

[20] Comes A, Rosso O, Orengo AM, et al. CD25+ regulatory T cell depletion augments immunotherapy of micrometastases by an IL-21-secreting cellular vaccine [J]. J Immunol, 2006, 176(3):1750-1758.

EffectofInterleukin21and/orInterleukin12ontheAntitumoractivityofPeripheralBloodMononuclearCellsinPatientswithEndometrialCancer

TIAN Yong-ju1, CUI Bao-xia1, MA Dao-xin2, ZHANG Yan1,3, HOU Fei1, ZHANG Wen-jing1

1Department of Obstetrics and Gynecology,2Haematology Oncology Center, Qilu Hospital,
Shandong University, Jinan 250012, China
3Department of Obstetrics and Gynecology, Weifang People’s Hospital, Weifang, Shandong 261041, China

CUI Bao-xia Tel: 0531-82169568，E-mail： baoxiacui@hotmail.com

ObjectiveTo observe the role of interleukin (IL) 21 alone, IL12 alone, and IL21 plus IL12 for inducing the antitumor activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with endometrial cancer.MethodsPBMCs were isolated from peripheral blood in patients with endometrial cancerinvitro, and kept the culture with low-level IL2. IL2-stimulated PBMCs were cocultured under different conditions (with anti-IL21 antibody, IL21 alone, IL12 alone, or IL21 plus IL12) for 72 h. The cytotoxicity of PBMCs was then examined by lactate dehydrogenase(LDH) released assay. CD4+CD25+FOXP3+T regulatory (Treg) cell and CD4+IL17A+T-helper (Th17) cell proportion were determined with flow cytometry. Cell proliferation and apoptosis were measured by cell counting kit-8(CCK-8)assay and flow cytometry, respectively.ResultsIn comparison to control group, both IL21 and IL12 significantly enhanced the cytotoxicity of PBMCs. The IL21 plus IL12 group had superior effect to IL21 alone and IL12 alone. IL21 and IL12 significantly decreased the percentages of Treg cells and the rate of PBMCs apoptosis. IL21 or IL12 had no significant effect on the differentiation of Th17 cells and the proliferation of PBMCs.ConclusionsIL21 and IL12 can enhance the cytotoxicity of PBMCs in patients with endometrial cancer, which can be further strengthened with treatment of IL21 plus IL12. Such effects may be achieved by inhibiting the differentiation of Treg cells and the apoptosis of PBMCs, but not by the differentiation of Th17 cell.

cytokines; peripheral blood mononuclear cells; cytotoxicity; regulatory T cells; T helper 17 cells

ActaAcadMedSin, 2011,33(3):292-298

崔保霞 電話：0531-82169568, 電子郵件：baoxiacui@hotmail.com

R737.33

A

1000-503X(2011)03-0292-07

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.03.017

國家自然科學(xué)基金(30400475)、山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金計劃(2006BS03060)和留學(xué)回國科研基金 Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30400475), the Shandong Technological Development Project (2006BS03060)，and the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars

2010-10-12)