胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA體外轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞的方法探討

陳江 郭曉鐘

·論著·

胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA體外轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞的方法探討

陳江 郭曉鐘

目的探討將胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞(DCs)最優(yōu)化的方法。方法以rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞以獲得DCs，觀察DCs的形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面標(biāo)志CD40、HLA-DR、CD83和CD86表達(dá)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測(cè)定DCs刺激異體T細(xì)胞增殖的能力。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔及被動(dòng)轉(zhuǎn)染三種方法將MiaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染DCs，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)MUC1 mRNA表達(dá)，MTT法測(cè)定DCs存活率。結(jié)果所獲細(xì)胞具有典型的成熟DCs形態(tài)特征，CD40、HLA-DR、CD83和CD86陽性表達(dá)率分別為34.3%、50.2%、89.2%和73.6%，對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞具有極強(qiáng)的刺激增殖作用。電穿孔法DCs轉(zhuǎn)染48 h后， DCs的MUC1 mRNA表達(dá)量為45.39±9.33，明顯高于脂質(zhì)體法的31.68±7.25和被動(dòng)轉(zhuǎn)染法的18.53±3.26；DCs存活率為(80.36±2.43)%，較被動(dòng)轉(zhuǎn)染法的(91.48±5.42)%略低，但高于脂質(zhì)體法的(67.44±2.51)%，且基本穩(wěn)定在80%左右。結(jié)論采用電穿孔法將胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA體外轉(zhuǎn)染DCs的效率較高，且較安全。

胰腺腫瘤； 樹突細(xì)胞； RNA轉(zhuǎn)染

樹突細(xì)胞(dendrtic cells, DCs)腫瘤疫苗在抗腫瘤免疫治療中的作用正受到學(xué)界的廣泛關(guān)注，已開展的幾項(xiàng)早期臨床研究證實(shí)，其對(duì)多種類型腫瘤有顯著的治療效果[1]。構(gòu)建DCs腫瘤疫苗的關(guān)鍵點(diǎn)之一在于腫瘤抗原負(fù)載方式的選擇，而近年來出現(xiàn)的RNA轉(zhuǎn)染DCs構(gòu)建腫瘤疫苗的方法在臨床應(yīng)用方面獨(dú)具優(yōu)點(diǎn)[2]。然而迄今為止尚無胰腺癌細(xì)胞這方面的報(bào)道。本研究通過觀察胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2的MUC1表達(dá)和DCs存活率的變化，探索RNA轉(zhuǎn)染DCs的最優(yōu)方法，為胰腺癌腫瘤疫苗構(gòu)建和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、胰腺癌細(xì)胞總RNA提取及DCs培養(yǎng)、鑒定

人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室保存。將其接種于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，選用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA備用。

取20例健康志愿者和8例胰腺癌患者外周血，均獲得志愿者和患者的知情以及醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。通過Ficoll-paqueTplus密度梯度離心法分離獲取單核細(xì)胞(MCs)，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁1 h后，取出未貼壁的細(xì)胞另做培養(yǎng)備用外，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20 h，加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)再培養(yǎng)5 d后加入TNF-α(10 ng/ml)，培養(yǎng)至第10天，收集成熟DCs。使用倒置顯微鏡和電鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5～10 d的DCs的形態(tài)學(xué)變化。收集DCs，分裝5管，分別加入鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83、CD86熒光單抗和作為對(duì)照的熒光標(biāo)記的同種型IgG(Santa-Cruz，USA)，用流式細(xì)胞儀分析，每個(gè)樣品分析細(xì)胞數(shù)>1×106。

二、DCs刺激同種異體T細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)

采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)方法。以成熟DCs作為刺激細(xì)胞，以異體未貼壁的MCs作為反應(yīng)細(xì)胞，按照刺激與效應(yīng)細(xì)胞1∶10、1∶20、1∶40、1∶80和1∶160比例分別加入到96孔板中，終體積200 μl，以同種同體T細(xì)胞+DCs作為對(duì)照組。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 d，收獲細(xì)胞前18 h每孔加入3H-TdR(中科院原子能所)1 μCi，采用液閃爍儀檢測(cè)每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。

三、MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DCs

收集的DCs經(jīng)洗滌后，采用Opti-MEM重懸，調(diào)節(jié)DCs濃度為2×106/ml。取3 μg MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA加入1 ml DCs中，而后分別參考Kalady等[3]的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和Fujii等[4]的電穿孔法及被動(dòng)轉(zhuǎn)染方法，將混合細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育0、12、24、48、72、96 h。

四、RNA轉(zhuǎn)染后DCs的MUC1 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(QRT-PCR)檢測(cè)。應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MUC1及次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)引物，并經(jīng)Gene bank驗(yàn)證。MUC1上游5′-TGAGTGATGTGC-3′，下游5′-CTG-CCCGTAGTTCTTTCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物158 bp；HPRT上游5′-GGTTCTCGGGGCACCTCT-3′，下游5′-TCGGCTTGAAATGACCTAATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物221 bp。收集使用3種方法轉(zhuǎn)染0～96 h的DCs 1×106個(gè)，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。按Sensiscript RT Kit(Qiagen，Germany)說明書行RT反應(yīng)。在Exicycler 96定量PCR儀(South Korea)上，按照QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)說明書行PCR。反應(yīng)條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s， 40個(gè)循環(huán)，最后68℃ 60 s。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法依據(jù)公式F=(待測(cè)樣品目的基因濃度/待測(cè)樣品看家基因濃度)/(對(duì)照組目的基因濃度/對(duì)照組看家基因濃度)[5]，對(duì)MUC1 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量，每個(gè)樣品重復(fù)2次，取均值。

五、DCs存活率檢測(cè)

將采用三種方法轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA的DCs接種在96孔板上，調(diào)整細(xì)胞濃度(5×106～10×106)/ml，體積180 μl，培養(yǎng)0、12、24、48、72、96 h，加入MTT 20 μl，37℃孵育4 h。棄上清液，每孔加DMSO 100 μl，震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)A490值，以未轉(zhuǎn)染DCs作為對(duì)照。細(xì)胞存活率=(轉(zhuǎn)染組A490值/對(duì)照組A490值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、DCs的形態(tài)變化、表面標(biāo)志及抗原遞呈能力

培養(yǎng)第5天，細(xì)胞多懸浮生長并聚集成團(tuán)(圖1a)，但結(jié)合較松散，輕吹打即可分散漂浮，漂浮細(xì)胞邊緣呈毛茸狀(圖1b)；電鏡下見胞體表面粗糙，向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起，部分突起末端呈球狀膨大(圖1c)，培養(yǎng)第10天，胞核染色深，偏向一側(cè)，形狀不規(guī)則，分葉狀，具有典型的DC形態(tài)特征(圖1d)。健康志愿者與胰腺癌患者M(jìn)Cs培養(yǎng)形成的DCs在形態(tài)方面無明顯差別。成熟DCs的表面標(biāo)志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86均陽性表達(dá)(圖2)，陽性表達(dá)率分別為34.3%、50.2%、89.2%和73.6%。成熟DCs具有極高的抗原遞呈能力，對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞具有極強(qiáng)的刺激增殖作用。健康志愿者與胰腺癌患者DCs的刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力無顯著性差異(P>0.05，圖3)。

圖1體外培養(yǎng)的健康志愿者和胰腺癌患者外周血DCs細(xì)胞的光鏡(a、b)和電鏡觀察(c、d)

圖2體外培養(yǎng)的健康志愿者和胰腺癌患者外周血成熟DCs細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

二、MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染后DCs的MUC1 mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染后24、48 h DCs細(xì)胞MUC1 mRNA表達(dá)水平漸強(qiáng)，72、96 h表達(dá)漸弱，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中電轉(zhuǎn)染的DCs的MUC1 mRNA表達(dá)水平較脂質(zhì)體和被動(dòng)轉(zhuǎn)染的DCs強(qiáng)(P<0.05，表1)。

圖3健康志愿者與胰腺癌患者DCs刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力

三、DCs存活率

被動(dòng)轉(zhuǎn)染法對(duì)DCs存活率變化影響最小，且在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率相差不大；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)細(xì)胞毒性作用較明顯，DCs存活率呈時(shí)間依賴性顯著下降；電轉(zhuǎn)染法對(duì)DCs有一定的毒性作用，細(xì)胞存活率較被動(dòng)轉(zhuǎn)染法低，但不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率變化不大，穩(wěn)定在80%左右(圖4)。

圖4 三種轉(zhuǎn)染方法的DCs存活率

討 論

DC腫瘤疫苗作為一種主動(dòng)免疫的抗腫瘤方法，能夠通過激活自身免疫系統(tǒng)，識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，并可使機(jī)體免疫系統(tǒng)獲得長期監(jiān)視和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的能力[6]。因其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷遵循0級(jí)動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，有可能徹底清除腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是胰腺癌免疫治療中的最具前途的方法之一。

本實(shí)驗(yàn)將GM-CSF、IL-4和TNF-α聯(lián)合作用人外周血MCs獲得DCs，無論是健康志愿者還是胰腺癌患者，所獲的目標(biāo)細(xì)胞均具有典型的DC形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞表面有HLA-DR、CD40、CD83和CD86等成熟DCs表面標(biāo)志物的陽性表達(dá)，均具有較強(qiáng)的抗原呈遞能力。

RNA轉(zhuǎn)染DCs的腫瘤疫苗具有顯著的優(yōu)點(diǎn)[7]：轉(zhuǎn)染的RNA只進(jìn)入DCs胞質(zhì)而非胞核，對(duì)細(xì)胞的損傷小；RNA半衰期短，RNA轉(zhuǎn)染的DC疫苗更為安全；負(fù)載的腫瘤抗原可從很少量的癌細(xì)胞中經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得；RNA模板本身可經(jīng)進(jìn)一步的序列修飾，穩(wěn)定性較強(qiáng)。目前常用的以RNA轉(zhuǎn)染DCs的方法主要有RNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物、被動(dòng)轉(zhuǎn)染和電穿孔法等。

表1 三種方法轉(zhuǎn)染的DCs的MUC1 mRNA表達(dá)

注：與被動(dòng)轉(zhuǎn)染法比較，aP<0.05；與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法比較，bP<0.05；與對(duì)照組(0 h)和其他時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05

被動(dòng)轉(zhuǎn)染法是將RNA和DCs共孵育，憑借DCs所具有的吞噬能力達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的。本實(shí)驗(yàn)采用被動(dòng)轉(zhuǎn)染法將MiaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DCs后，胰腺癌相關(guān)抗原MUC1弱陽性表達(dá)，轉(zhuǎn)染前后DCs存活率變化不大。提示此法雖對(duì)DCs本身的損傷較小，但轉(zhuǎn)染時(shí)間較長，RNA易被降解，轉(zhuǎn)染率較低。

以陽離子脂質(zhì)體作為載體轉(zhuǎn)染DCs是目前應(yīng)用最多的一種方法。Lu等[8]采用該法轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系，獲得了報(bào)告基因mRNA的高表達(dá)。但陽離子脂質(zhì)體本身具有毒性，且轉(zhuǎn)染所需時(shí)間長。本實(shí)驗(yàn)采用該法轉(zhuǎn)染的DCs雖有較強(qiáng)的MUC1表達(dá)，但DCs存活率下降顯著。明顯的細(xì)胞毒性可能會(huì)限制其臨床應(yīng)用。

電穿孔法是一種效率較高的轉(zhuǎn)染方法，穿孔過程僅需1 s，整個(gè)過程僅5 min，故特別適用于半衰期短、易降解的RNA轉(zhuǎn)染[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用電穿孔法轉(zhuǎn)染的DCs有較強(qiáng)的MUC1表達(dá)，DC表面抗原的表達(dá)量明顯高于其他兩種方法，且轉(zhuǎn)染前后DCs生存率無顯著變化，穩(wěn)定在80%左右。提示電穿孔法不但轉(zhuǎn)染效率較高、且較為安全，可能是構(gòu)建RNA轉(zhuǎn)染DCs胰腺癌腫瘤疫苗的最優(yōu)方法。

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2010-07-26)

(本文編輯：屠振興)

OptimizingmethodofpancreaticcancerMiaPaCa-2cellstotalRNA-transfecteddendrticcells

CHENJiang,GUOXiao-zhong.

DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110016,China

GUOXiao-zhong,Email:Guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the best method of transfecting total RNA extracted from pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells into dendrtic cells (DCs).MethodsDCs were cultured from peripheral blood mononuclear cells induced by rhGM-CSF, rhIL-4 and TNF-α. Morphology of DCs was observed. Flow cytometry was used to detect the mature DCs specific surface markers: CD40, HLA-DR, CD83, CD86. Mixed lymphocyte (MLR) was used to determine the ability of DCs to stimulate allogeneic T cell proliferation. Liposomal transfection, electroporation method and passive transfection was used to transfect MiaPaCa-2 cell total RNA into DCs, Real time RT-PCR and MTT assay was used to determine the expression of MUC1 mRNA and the survival rate of the RNA transfected DCs.ResultsThe cells acquired showed typical DCs morphology, the positive rate of CD40, HLA DR, CD83and CD86were 34.3%,50.2%,89.2%and73.6%, and they showed a strong ability to stimulate allogeneic T cell proliferation. 48 h after transfection with MiaPaCa-2 cells total RNA by using electroporation, the MUC1 mRNA amount (45.39±9.33) in DCs was higher than that of liposomes method (31.68±7.25) and passive transfection method (18.53±3.26)。DCs survival rate was (80.36±2.43)% by using electroporation, which was relatively lower than (91.48±5.42)%by using passive transfection method, but higher than (67.44±2.51)% by using liposomes method, and it was stabilized around 80%.ConclusionsTransfecting total RNA extracted from pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells into DCs with electroporation is efficient and safe.

Pancreatic neoplasms； Dendritic cells； RNA Transfection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.008

110016 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科

郭曉鐘，Email:Guoxiaozhong1962@163.com