建立牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

王宗春，周延安，張 洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

建立牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

王宗春，周延安，張 洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

目的建立牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。方法按照中國藥典2010年版(二部)附錄Ⅺ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液經(jīng)100倍稀釋后，用靈敏度λ為0.5 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，供試品不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)論建立的牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查可行。

細(xì)菌內(nèi)毒素; 鱟試劑; 牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液; 干擾試驗(yàn)

牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液為無色至淡黃色的水性澄明溶液，臨床適用于頸、肩、腕綜合癥及腰痛癥病人的病痛、冷感、麻木等癥狀的緩解，另外也可用于治療癥狀性神經(jīng)痛等。牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液暫未收入中國藥典，也尚無國家標(biāo)準(zhǔn)，其企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)中采用熱原檢查法(家兔法)控制熱原，但家兔法存在試驗(yàn)條件要求較高、操作繁瑣和影響因素較多等缺點(diǎn)，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏快速、簡便易行及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被各國藥典所采用，目前尚未有牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的報(bào)道，筆者參照中國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]以及《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2005年版[2]，對本品進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液(威世藥業(yè)有限公司，規(guī)格3 ml，批號20091007-1，20091103-2，20091209-1)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，規(guī)格50 ml，批號091107)；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物制品檢定所，規(guī)格10 EU，批號2009-7)；鱟試劑(TAL，廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，規(guī)格0.1 ml，批號091149，標(biāo)示靈敏度0.5 EU/ml)；鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格0.1 ml，批號090325，標(biāo)示靈敏度0.5 EU/ml)；恒溫水浴箱(江蘇南通嘉程儀器有限公司)；微量取液器(50～250 μl)(上海金林生化試劑儀器廠)；SW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度復(fù)核 按《中國藥典》2010年版二部附錄XI E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]進(jìn)行操作，結(jié)果表明兩個(gè)批號的鱟試劑靈敏度測定值λc均在0.5λ～2.0λ之間，符合規(guī)定，可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L =K/M[1]，式中K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，按照牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液說明書用法用量，M為0.05 ml/(kg·h)，求得L=K/M=100 EU/ml?？紤]到牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液成分較為復(fù)雜，為嚴(yán)格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L定為50 EU/ml為宜。

2.3樣品最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定 樣品最大有效稀釋倍數(shù)MVD= L/λ，其中L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值(50 EU/ml)，λ為鱟試劑靈敏度，本試驗(yàn)中λ為 0.5 EU/ml，對應(yīng)的樣品MVD為100，即稀釋倍數(shù)不超過100倍的供試品溶液均可用于干擾試驗(yàn)。

2.4干擾預(yù)試驗(yàn)[3，4]用BET水將牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液稀釋至20、40、80、100倍的系列溶液，與原液一起作為供試品陰性對照(NPC)系列，測定pH值，均在6.5～7.0范圍內(nèi)。另制備同樣倍數(shù)的供試品系列溶液，使每一稀釋度的供試品溶液中都含有2 λ(λ為0.5 EU/ml)細(xì)菌內(nèi)毒素，作為供試品陽性對照(PPC)系列。每一供試品濃度重復(fù)兩管，按常規(guī)設(shè)立陽性對照(PC)管和陰性對照(NC)管。用λ為0.5 EU/ml的鱟試劑與上述系列溶液進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見表1，可以看出原液對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)有抑制作用，20倍或更大倍數(shù)稀釋液不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

表1 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.5干擾試驗(yàn) 根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用供試品100倍稀釋溶液及BET水分別稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，配成細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度分別為1.0、0.5、0.25、0.125 EU/ml的系列溶液，分別取0.1 ml加入到已復(fù)溶的兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(λ為0.5 EU/ml)管內(nèi)，每個(gè)濃度平行做4管，另取供試品溶液做2支陰性對照管，進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見表2，Et/ Es在0.5～2之間(Es為用BET水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值)，按照中國藥典2010年版(二部)判斷標(biāo)準(zhǔn)，供試品100倍稀釋溶液對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)無干擾，可以使用鱟試劑方法檢查牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素。

表2 100倍樣品稀釋溶液干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.6家兔法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對比研究 取3批經(jīng)家兔法檢查合格的牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液，配制成100倍稀釋溶液，使用兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑(靈敏度λ均為0.5 EU/ml)，按中國藥典2010年版(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，結(jié)果全部符合規(guī)定，詳見表3。

表3 供試品家兔法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查結(jié)果

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中要求供試溶液的pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)，過酸、過堿的供試品需調(diào)節(jié)其pH值。因此，在試驗(yàn)中用pH計(jì)測定了樣品原液及20、40、80、100倍系列溶液的pH值，結(jié)果均在6.5～7.0之間，不需調(diào)整，可直接用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

本試驗(yàn)可以將樣品稀釋至100倍直接進(jìn)行干擾試驗(yàn)，為了掌握樣品濃度對鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，對樣品原液及20、40、80、100倍系列溶液進(jìn)行了干擾預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果表明只有樣品原液干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。由表2干擾試驗(yàn)結(jié)果可以看出，3批樣品經(jīng)稀釋100倍后，分別使用兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(靈敏度均為0.5 EU/ml)進(jìn)行干擾試驗(yàn)，其Et/Es均在0.5～2.0范圍內(nèi)，確認(rèn)樣品在該稀釋倍數(shù)下不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法如下：將本品稀釋100倍，依照中國藥典2010年版(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢查，細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為50 EU/ml。

[1] 中國藥典2010版. 二部[S]. 2010. 附錄99.

[2] 中國藥品生物制品檢定所. 中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2005: 287.

[3] 高 錦，付 聰，嵇 揚(yáng)，等. 復(fù)方氯解磷定注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法[J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志，2008，26(2)：133.

[4] 胡宇馳，楊赟昀，朱春玥，等. 醋酸戈舍瑞林緩釋植入劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究[J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28(1)：36.

2010-08-12

[修回日期]2010-11-21

Establishmentofbacterialendotoxinstestinextractsinjectionfromrabbitskininflamedbyvacciniavirus

WANG Zong-chun, ZHOU Yan-an, ZHANG Hong

(Department of Pharmacy, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,China)

ObjectiveTo establish a method for the detection of bacterial endotoxin in extracts injection from rabbit skin inflamed by vaccinia virus.MethodsThe interference test was carried out according to the guideline and procedure specified in appendix Ⅺ E, volume two, chinese pharmacopoeia 2010 edition.ResultsBy using tachypleus amebocyte lysates which sensitivity was 0.5 EU/ml, the sample did not interfere with the bacterial endotoxins test when it was diluted 100 times.ConclusionThe established method of bacterial endotoxins test for extracts injection from rabbit skin inflamed by vaccinia virus was feasible.

bacterial endotoxins；tachypleus amebocyte lysate；extracts injection from rabbit skin inflamed by vaccinia virus ;the interference test

王宗春(1967-)，男，副主任藥師. E-mail:w-zongchun@163.com.

R927.12

A

1006-0111(2011)02-0128-03