正交試驗(yàn)優(yōu)選鐮形棘豆總黃酮活性炭脫色工藝

杜青云，洪佳妮，李茂星,陳錦珊

(1.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361005； 2.解放軍第175醫(yī)院藥劑科，福建 漳州 363000； 3.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，甘肅 蘭州 730050)

正交試驗(yàn)優(yōu)選鐮形棘豆總黃酮活性炭脫色工藝

杜青云1，2，洪佳妮1，2，李茂星3,陳錦珊2

(1.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361005； 2.解放軍第175醫(yī)院藥劑科，福建 漳州 363000； 3.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，甘肅 蘭州 730050)

目的優(yōu)選鐮形棘豆總黃酮活性炭脫色工藝。方法以溫度、時(shí)間和活性炭用量為考察因素，脫色液顏色、260～420 nm紫外吸收情況和總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法探究最佳脫色條件。結(jié)果脫色最佳工藝為在40 ℃下，加入1 %活性炭，攪拌5 min。結(jié)論該脫色工藝可行，既能達(dá)到脫色效果，又能保留有效成分。

鐮形棘豆；總黃酮；脫色工藝；正交試驗(yàn)

鐮形棘豆在藏藥中稱為草藥之王，多年生草本，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈止血、通利大便等功效[1]。它主要產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、甘肅南部、四川西部，是一種豐富的藏藥資源，現(xiàn)代研究表明黃酮類化合物是其主要化學(xué)成分[5]，在波長(zhǎng)260～420 nm具有明顯的吸收。從該植物提取精制具有紫外線吸收功能的總黃酮成分，可進(jìn)一步制成天然防曬護(hù)膚品[3]。然而利用總黃酮提取物制得的霜?jiǎng)┏３庶S褐近黑色，不利于該防曬品的開發(fā)?；钚蕴渴且环N良好的吸附劑，具有吸附量大、再生速度快、污染小等優(yōu)點(diǎn)[4]。本文以總黃酮提取物為原料，粉末活性炭為脫色劑，研究影響鐮形棘豆總黃酮提取液的脫色因素，探討最佳脫色條件。

1 儀器與材料

1.1儀器 分析天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廈門精藝興業(yè)科技有限公司，N-1001D-WA)，磁力加熱攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，pH計(jì)(常州遠(yuǎn)宇干燥設(shè)備有限公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(天美科技有限公司，U2810)。

1.2材料 鐮形棘豆(購(gòu)自甘肅省曲瑪縣黃河源藥材公司，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院趙汝能教授鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆OxytropisfalcataBunge全草)；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，200707)；二氯氧鋯(ZrOCl2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，F(xiàn)20090814)；活性炭(廣東汕頭市西隴化工廠有限公司，20090917)；無(wú)水三氯化鋁(上海宏瑞化工有限公司，20081220)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20091021)，無(wú)水甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20090416)。

2 方法與結(jié)果

2.1鐮形棘豆總黃酮的提取與精制 稱取藥材200 g，粉碎，加10倍量95%乙醇浸泡3 d，重復(fù)浸泡3次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至較少體積，用石油醚脫脂，大孔樹脂富集純化[5]，濃縮至浸膏，真空干燥得提取物。

2.2總黃酮含量測(cè)定[6,7]

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照文獻(xiàn)采用二氯氧鋯比色法進(jìn)行測(cè)定，得453 nm 下對(duì)照品溶液各濃度的吸光度。以吸光度(y)對(duì)蘆丁濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:y=0.048 4x+0.015 5，r=0.999 8。

2.2.2樣品測(cè)定 精密稱取鐮形棘豆提取物0.01 g 3份，分別用無(wú)水乙醇溶解至10 ml容量瓶，得供試品溶液。同樣參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行水解顯色，測(cè)定453 nm的吸光度值，根據(jù)回歸方程求出供試液中總黃酮濃度，計(jì)算提取物的總黃酮含量，取平均值，得含量為19.50%。

2.3單因素考察 選取脫色溫度、脫色時(shí)間、活性炭用量3個(gè)影響因素，分別做單因素試驗(yàn)。具體操作如下：取25 ml燒杯，分別加入10.0 ml提取液(提取物0.01 g，加10 ml無(wú)水乙醇溶解，呈深黃褐色，經(jīng)pH計(jì)測(cè)定，其pH值為5.0)，按設(shè)計(jì)要求，加入適量的活性炭，置于磁力加熱攪拌器，在設(shè)定的溫度下攪拌脫色至相應(yīng)的時(shí)間。脫色后趁熱過(guò)濾，收集濾液，取各濾液1 ml，至10 ml容量瓶，加入1 ml 4%三氯化鋁溶液，用50%乙醇定容。以隨行試劑為空白，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定260～420 nm的吸光度。

2.3.1溫度對(duì)脫色效果的影響 設(shè)置30、40、50、60、70 ℃五個(gè)脫色處理溫度，按1.0%的活性炭用量，置于磁力加熱攪拌器攪拌10 min。比較濾液顏色，得顏色由深至淺依次為：30 ℃(淺黃微褐色)、40 ℃(淺黃色)、50 ℃(微黃色)、60 ℃(近無(wú)色)、70 ℃(無(wú)色)。測(cè)定紫外吸收值，結(jié)果見圖1。由圖可知，70 ℃和60 ℃下的紫外吸收較好，其次為40 ℃，但試驗(yàn)中溫度越高，得到的脫色濾液量越少，故綜合考慮，脫色溫度以40 ℃左右為宜。

圖1 不同溫度下鐮形棘豆提取液脫色所得濾液的紫外吸收曲線

2.3.2時(shí)間對(duì)脫色效果的影響 設(shè)置5、10、15、20 min 4個(gè)脫色時(shí)間，按1.0%的活性炭用量，分別攪拌5、10、15、20 min。比較濾液顏色，得顏色由深至淺依次為：5 min(淺黃褐色)、10 min(淺黃色)、15 min(淡黃色)、20 min(近無(wú)色)。測(cè)定紫外吸收值，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著脫色時(shí)間增加，脫色濾液的紫外吸收值越小，所得濾液量也越少。故綜合考慮，脫色時(shí)間以10 min左右為宜。

圖2 鐮形棘豆提取液不同脫色時(shí)間所得濾液的紫外吸收曲線

2.3.3活性炭用量對(duì)脫色效果的影響 設(shè)置0.5%、1%、1.5%、2%4個(gè)活性炭用量，在40 ℃下分別脫色10 min。比較濾液顏色，得顏色由深至淺依次為：0.5%(淺黃褐色)、1%(微黃褐色)、1.5%(近無(wú)色)、2%(無(wú)色)。測(cè)定紫外吸收值，結(jié)果見圖3。由圖可知，隨著活性炭用量增加，脫色濾液的紫外吸收值越小，所得濾液量也越少。故綜合考慮，活性炭用量以1%左右為宜。

圖3 鐮形棘豆提取液不同活性炭用量所得濾液的紫外吸收曲線

2.4正交試驗(yàn)

2.4.1因素水平選擇 影響活性炭脫色的因素較多，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.4.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 取20.0 ml總黃酮提取液，按正交試驗(yàn)方案進(jìn)行脫色。收集各脫色濾液，比較顏色。取1 ml濾液同前于紫外分光光度計(jì)上測(cè)260～420 nm的吸收值，見圖4，10為提取液脫色前的紫外吸收情況。另取1 ml濾液，參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行水解顯色[6]，測(cè)定453 nm的吸光度值，計(jì)算各條件下所得脫色液總黃酮含量。

2.4.3數(shù)據(jù)處理 以濾液顏色、260～420 nm紫外吸收情況、總黃酮含量三項(xiàng)作為衡量脫色效率的考察指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法。設(shè)定濾液顏色無(wú)色為100分，圖4中10號(hào)即脫色前提取液的紫外吸收為100分，對(duì)二者進(jìn)行量化評(píng)分。將各項(xiàng)指標(biāo)除以該列最大值再乘以100，為該項(xiàng)得分。根據(jù)三項(xiàng)指標(biāo)權(quán)衡，確定三者的權(quán)重系數(shù)為0.4、0.3、0.3，對(duì)三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，得到綜合評(píng)分，分值越大說(shuō)明該脫色條件脫色效果越好，有效成分保留越多。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

圖4 正交試驗(yàn)各脫色濾液的紫外吸收曲線

NO因素水平ABC顏色深淺分值吸收度分值總黃酮含量%綜合評(píng)價(jià)總分11111淺黃褐色358516.4376.3321222微黃褐色65257.1449.9231333微黃近無(wú)色80100.1037.4142123微黃淡褐色705511.9671.8952231近無(wú)色90203.2051.1162312淺黃淡褐色556013.3369.9773132微黃微褐色75203.8245.9883213淺黃淺褐色457515.8075.8093321近無(wú)色90121.3444.71K1163.66194.20222.10172.15K2192.97176.83166.52165.87K3166.49152.09134.50185.10Rj29.3142.1187.6019.23

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)= 19.00，“*”表示有顯著性影響。

由表2、表3可知，活性炭脫色的影響因素大小順序?yàn)?C>B>A，即活性炭用量影響最大，脫色時(shí)間影響次之，脫色溫度影響最小，其中活性炭用量對(duì)脫色效果有顯著性影響?？紤]脫色濾液量隨時(shí)間、溫度增加而減少，并結(jié)合脫色濾液顏色 ，確定最佳脫色工藝為A2B1C2，即在40 ℃下，加入1%活性炭，攪拌5 min。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取鐮形棘豆提取物0.01 g 3份，分別用無(wú)水乙醇溶解至10 ml容量瓶。將3份10 ml樣液按最佳脫色工藝進(jìn)行試驗(yàn)。收集脫色濾液，顏色為淺黃微褐色，同前測(cè)定260～420 nm紫外吸收度，并測(cè)定總黃酮含量分別為12.29%、11.47%、11.88%、。結(jié)果表明，該最佳脫色條件可行。

3 討論

3.1本研究中的鐮形棘豆總黃酮提取物為醇提物，并經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化而得。經(jīng)測(cè)定，提取物中的總黃酮含量為19.50%，較水提物提高許多[6]。提取液顏色為深褐近黑色，經(jīng)活性炭脫色后，顏色明顯改善，有利于防曬產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)。優(yōu)化的脫色工藝既能達(dá)到脫色效果，又能保留有效成分。

3.2測(cè)定紫外吸收度是評(píng)價(jià)防曬產(chǎn)品防曬性能的方法之一[8，9]。本研究的總黃酮成分在中波有較強(qiáng)的吸收，在長(zhǎng)波也有一定的吸收，測(cè)定260～420 nm的吸光度不僅能考察總黃酮的含量情況，還可進(jìn)一步說(shuō)明防曬效果。

3.3研究中使用的活性炭為黑色細(xì)微粉末，無(wú)臭、無(wú)味，具有無(wú)毒、脫色效果好的特點(diǎn)，可以反復(fù)使用，成本低。脫色液雖經(jīng)抽濾，但仍有少量活性炭殘?jiān)y于除去，故應(yīng)進(jìn)一步選用合適的活性炭粒度，以利于脫色后進(jìn)行過(guò)濾。

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2010-03-26

[修回日期] 2010-08-06

OptimizationofdecolorizationtechnologyoftheOxytropisfalcatatotalflavoneswithactivecarbonbyorthogonalexperiment

DU Qing-yun1,2, HONG Jia-ni1，2,LI Mao-xing3,CHEN Jin-shan2

(1.Department of Pharmacy, Medical College of Xiamen University, Xiamen 361005，China; 2.Department of Pharmacy, the 175th Hospital of PLA, Zhangzhou 363000，China; 3.Department of Pharmacy, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo optimize the decolorization technology ofOxytropisfalcatatotal flavones with active carbon.MethondsTemperature, stirring time and the content of active carbon were used as the orthogonal experiment factors. The colour of filtrate, the ultraviolet absorption between 260 nm to 420 nm and the content of total flavones were set as the indexes to investigate the optimal decolorization technology.ResultsThe optimal decolorization technology was achieved under the condition as 40 ℃, stirring 5 min with 1% active carbon.ConclusionThe decolorization technology is feasible which had good decolorization result and could hold effective ingredient.

Oxytropisfalcata; total flavones; decolorization technology; orthogonal experiment

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生“十一五”課題面上項(xiàng)目(06MB95)；南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題 (06MA-95)．

杜青云(1953-)，女，主任藥師，教授,碩士生導(dǎo)師.E-mail:175dqyun@163.com.

陳錦珊.Tel:(0596)2925193,E-mail:cjs1223@sohu.com.

R283

A

1006-0111(2011)02-0105-04