5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相關(guān)基因的變化

張海峰 秦金丹 周國雄 丁曉凌 黃介飛

5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相關(guān)基因的變化

張海峰 秦金丹 周國雄 丁曉凌 黃介飛

目前認(rèn)為，5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)代謝途徑異常是促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。其機(jī)制為促進(jìn)細(xì)胞過度增殖、抑制凋亡；促進(jìn)惡性腫瘤血管生成；提高惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的潛能、增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力；抑制5-LOX能使多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖減低并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。

本實驗利用基因芯片檢測靶向5-LOX的shRNA真核表達(dá)載體導(dǎo)入SW1990細(xì)胞形成的裸鼠皮下移植瘤內(nèi)并聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇(TL)治療后移植瘤組織基因表達(dá)譜的變化，探討沉默5-LOX基因表達(dá)治療胰腺癌的應(yīng)用價值。

一、材料與方法

1．裸鼠移植瘤模型制作及分組：取對數(shù)生長期SW1990細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×108個/ml，分裝于1 ml的無菌EP管中備用。18只BALB/cnu/nu裸鼠購自解放軍南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)動物實驗中心，在SPF級屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。取0.1 ml混勻的細(xì)胞懸液，注入每只裸鼠右側(cè)腋下。待移植瘤長至100 mm3左右(約10 d)按數(shù)字表法隨機(jī)分為靶向5-LOX的shRNA組、shRNA+TL組和對照組，每組6只。shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-ALOX5-1021由上海吉瑪公司構(gòu)建，正義鏈5′-CACCGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTTCAAGAGAATACAGCA-AGCAGATGGGAGCTTTTTTG-3′；反義鏈5′-GATCCAAAA-AAGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTCTCTTGAAATACAGCAAG-CAGATGGGAGC-3′。shRNA瘤內(nèi)注射量為50 μg/只(0.1 ml)，3 d一次，共7次；TL腹腔內(nèi)注射劑量為0.25 mg/kg體重(0.2 ml)，每天一次，共19 d。第30天處死動物，取腫瘤組織，稱瘤重。取部分瘤組織，置-80℃冰箱保存。

2．移植瘤基因表達(dá)譜的檢測：采用Trizol試劑抽提移植瘤組織總RNA，采用 Cy5熒光標(biāo)記，應(yīng)用基因表達(dá)譜寡核苷酸芯片(31118個基因，上海生物芯片公司)進(jìn)行雜交，雜交條件：50℃ 16 h后 42℃洗片。芯片結(jié)果應(yīng)用 Agilent掃描儀掃描，采用 Genespring行 Normalize分析，處理組/對照組比值≥2為上調(diào)基因，≤0.5為下調(diào)基因。

3．RT-PCR驗證血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)：采用RT-PCR方法檢測。VEGF引物序列：上游5′-GGGCCT-CCGAAACCATGAACTT-3′，下游5′-TCGCATCAGGGGCAC-ACAG-3′， 擴(kuò)增片段260 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游5′-ATGCATTCACCT-CCCCTGTG-3′擴(kuò)增片段486 bp。引物由上海invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30次循環(huán)，72℃延伸7 min。

二、結(jié)果

1．一般情況：注射SW1990細(xì)胞懸液后裸鼠生長狀況良好，飲食以及活動正常，未出現(xiàn)驚恐、不安、拒食等情況。各組裸鼠治療前后的體重的改變無明顯差異(表1)。

2．裸鼠腫瘤生長情況：治療組腫瘤的生長速度減慢，移植瘤體積均小于同時點的對照組。第30天對照組平均瘤體積是用藥前的7.01倍；shRNA組是用藥前的3.11倍；shRNA+TL組是用藥前的1.97倍(圖1)。兩治療組的瘤重均較對照組顯著降低(P<0.05)，抑瘤率均達(dá)50%以上，但兩治療組間無顯著差異(表1)。

圖1注射SW1990細(xì)胞4周時shRNA+TL組(a)、shRNA組(b)和對照組(c)裸鼠的移植瘤生長情況

表1 各組裸鼠體重、移植瘤重及抑瘤率

注：與對照組比較，aP<0.05

3．差異表達(dá)基因：shRNA組上調(diào)基因401條，下調(diào)基因751條；shRNA +TL組上調(diào)基因760條，下調(diào)基因1254條。兩組共同下調(diào)的基因主要包括G蛋白耦聯(lián)受體基因、代謝相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞黏附相關(guān)基因及生長因子基因等，其中有VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞核因子、脂氧合酶同源性序列、表皮生長因子、NFkB 活化蛋白、血小板衍生生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)錄激活因子等(圖2)。經(jīng)RT-PCR驗證，兩治療組VEGF mRNA表達(dá)較對照組明顯減弱(圖3)。

圖3 各組移植瘤組織VEGF表達(dá)(RT-PCR)

討論眾多研究證實，胰腺癌組織中5-LOX mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高，而正常胰腺組織中未見表達(dá)。抑制5-LOX的表達(dá)可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加[2-3]。我們先前的研究表明，5-LOX抑制劑齊留通、雷公藤內(nèi)酯醇等處理胰腺癌SW 1990細(xì)胞后，細(xì)胞5-LOX mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，凋亡增加；同時VEGF表達(dá)下調(diào)；應(yīng)用靶向5-LOX的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體同樣可有效阻斷SW1990細(xì)胞5-LOX基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡[4-8]。本實驗應(yīng)用靶向5-LOX的shRNA載體瘤內(nèi)注射加或不加雷公藤內(nèi)酯醇注射制劑腹腔內(nèi)注射的方法治療裸鼠皮下移植瘤，兩治療組的抑瘤率均超過50%，但兩種治療方法的療效無顯著差異，無聯(lián)合治療的必要。通過基因芯片檢測，兩組共同下調(diào)的基因主要包括G蛋白結(jié)合受體基因、代謝相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞黏附相關(guān)基因及生長因子基因等，提示5-LOX代謝通路可以通過多條途徑影響生長因子基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。

[1] 李勇，李建英，王小眾.5-脂氧合酶促癌機(jī)制研究進(jìn)展.世界華人消化雜志，2006，14：800-804.

[2] Hennig R,Grippo P,Ding XZ, et al. 5-Lipoxygenase, a marker for early pancreatic intraepithelial neoplastic lesions. Cancer Res,2005,65:6011-6016.

[3] 吳深寶，周國雄，張弘，等.胰腺癌細(xì)胞中5-脂氧合酶mRNA和蛋白的表達(dá).胰腺病學(xué),2005,4:238-239.

[4] 周國雄，吳深寶，黃介飛，等.5-脂氧合酶特異性抑制劑對胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.中華消化雜志,2005,25:689-691.

[5] Zhou GX， Ding XL， Huang JF， et al． Suppression of 5-lipoxygenase gene is involved in triptolide-induced apoptosis in pancreatic tumor cell lines．Biochim Biophys Acta,2007,1770:1021-1027.

[6] 張海峰，周國雄，丁曉凌，等.抑制5-脂氧合酶表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.中華胰腺病雜志,2009,2:27-30.

[7] Ye YN,Shin VY,Cho CH,et al.Contributory role of 5-lipoxygenase and its association with angiogenesis in the promotion of inflammation2associated colonic tumorigenesis bycigarette smoking.Toxicology,2004,15:179-188.

[8] Romano M,Catalano A,Nutini M,et al.5-lipoxygenase regulates malignant mesothelial cell survival:involvement of vascular endothelial growth factor.FASEB J,2001,15:2326-2336.

2010-10-15)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.023

江蘇省重點醫(yī)學(xué)人才項目(RC2007085)；江蘇省衛(wèi)生廳重大課題(K200602)

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周國雄，Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn