石斛蘭SIZ1基因的克隆及序列分析

王亞琴， 鐘開新， 陽成偉， 梁 山

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；2.華南師范大學生命科學學院,廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東廣州 510631)

石斛蘭SIZ1基因的克隆及序列分析

王亞琴1,2*， 鐘開新1， 陽成偉2， 梁 山2

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；2.華南師范大學生命科學學院,廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東廣州 510631)

首次從石斛蘭中克隆到1個類SIZ1基因，命名為DenSIZ1, 運用生物信息學軟件分析與預測其蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域與亞細胞定位．結(jié)果表明，DenSIZ1可能屬于PIAS家族SUMO E3連接酶，包括3個重要的功能結(jié)構(gòu)域SAP、PHD和zf-MIZ，且該蛋白可能定位于細胞核中，與PIAS家族有較高的同源性．

石斛蘭； SUMO E3連接酶； 基因克??； 序列分析

植物的SUMO化途徑參與有機和無機脅迫反應、植物開花及生長發(fā)育等生理過程[1]．在擬南芥中存在著PIAS保守序列的SUMO E3酶AtSIZ1，其促進轉(zhuǎn)錄因子PHR1和ICE1的SUMO化修飾，其中PHR1參與調(diào)節(jié)磷酸饑餓信號途徑，ICE1參與調(diào)節(jié)低溫脅迫反應[2-3]．而且，AtSIZ1是磷饑餓應激反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，也是SA途徑和受PAD4(肽?；彼崦搧啺泵?4)調(diào)節(jié)的R基因信號傳遞途徑的關(guān)鍵酶，這2條途徑與擬南芥的初級免疫相關(guān)；此外，AtSIZ1還參與植物生長調(diào)節(jié)、干旱和低溫耐受應激響應．本研究首次從石斛蘭基因組中克隆到1個與擬南芥SIZ1氨基酸序列高度同源的類SIZ1基因，命名為DenSIZ1(DendrobiumSIZ1)．運用生物信息學軟件，對其蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域與亞細胞定位等進行了分析與預測,同時構(gòu)建了過表達載體轉(zhuǎn)化Atsiz1突變體,為研究DenSIZ1基因的功能，探討該基因與植物生長和各種非生物脅迫應激反應之間的機制奠定基礎．

1 材料與方法

1.1實驗材料

石斛蘭(Dendrobium)cDNA由華南師范大學生命科學學院石斛蘭課題組惠贈，以20～30 d冷處理植株提取總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為供試材料．

1.2DenSIZ1基因引物設計

從石斛蘭cDNA文庫中篩選到與AtSIZ1的5′端核酸序列和氨基酸序列同源性較高的序列.根據(jù)篩選到的核酸序列用Primer Premier5設計3′RACE中間特異引物：DenSIZ1-GSP1: 5′-GCAAAGCAAGGAAAGAAGCGGG-3′;DenSIZ1-GSP2: 5′-TCCAGAGGAAAGGGATGAAACCAG-3′;DenSIZ1-GSP3: 5′-GTTCGTTGCTTTTGTGGGGTTAC-3′, 根據(jù)在基因PolyA上連接的一段特異性序列設計的3′CDSⅢ與3′RACE中間特異引物進行擴增，測序結(jié)果與5′端序列拼接獲得初始DenSIZ1 cDNA序列．通過NCBI-ORF Finder查找開放閱讀框，與AtSIZ1序列比對確定DenSIZ1編碼區(qū)．其中3′CDSⅢ：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3′，DenSIZ1基因特異引物：DenSIZ1-F: 5′-GGTACCCATGGATTTGGCCATCAGTTG-3′；DenSIZ1-R: 5′-GCCCTCACTAGTAGATAAGACTTGACCATTGTC-3′．

1.3DenSIZ1基因的克隆與測序

以石斛蘭cDNA為模板，PCR反應體系包括：Premix LA Taq 25 μL, cDNA模板1 μL，正向和反向引物各1 μL(20 μmol/L),加水至50 μL，混勻離心．3′RACE法擴增反應條件為：94 ℃預變性4 min; 94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min．DenSIZ1全長基因擴增反應條件為：94 ℃預變性4 min; 94 ℃變性30 s, 62 ℃退火30 s, 72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min．通過中間特異引物與3′RACE特異引物進行PCR擴增，在確定目標產(chǎn)物序列的前提下，再設計DenSIZ1基因特異引物進行PCR擴增獲得DenSIZ1全長基因．

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和DNA膠回收試劑盒純化，克隆到pMD20-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR檢測及質(zhì)粒酶切鑒定，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序．

1.4DenSIZ1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析

DenSIZ1蛋白結(jié)構(gòu)分析通過ExPASy在線ScanProsite完成；利用在線工具TMHMM分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)翻譯后修飾的糖基化位點和磷酸化位點分析采用DictyOGlyc在線軟件和NetPhos2.0 Server分析；利用GOR在線工具完成DenSIZ1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測；通過ExPASy提供分析工具ProtScale分析蛋白的親疏水性；利用Pfam進行DenSIZ1的結(jié)構(gòu)域功能分析；通過WOLF PSORT進行DenSIZ1蛋白亞細胞定位預測．

1.5DenSIZ1分子進化樹的構(gòu)建

從GeneBank數(shù)據(jù)庫中收集到29條SUMO E3 ligase 蛋白序列，其中3條來自植物，其余來自動物．利用Lasegene-MegAlign軟件的ClustalW2法進行序列比對，并構(gòu)建DenSIZ1的分子進化樹．

2 結(jié)果與分析

2.1DenSIZ1基因的克隆及鑒定

以石斛蘭cDNA為模板，運用3′RACE法, 經(jīng)中間特異引物DenSIZ1-GSP1、DenSIZ1-GSP2、Den-SIZ1-GSP3與3′CDSⅢ進行PCR擴增，最終確定目的條帶為2 200 bp 左右DNA片段(圖1)．PCR產(chǎn)物純化后, 連接到pMD20-T載體，挑取陽性克隆進行PCR鑒定，測序后獲得DenSIZ1 3′端序列，與已知5′端序列拼接形成DenSIZ1全長序列．

根據(jù)上述已知的DenSIZ1全長序列，設計Den-SIZ1全長特異引物DenSIZ1-F和DenSIZ1-R，克隆2.6 kb左右的DNA片段(圖2)．連接pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，取6個平行陽性克隆子的測序，分析后獲得含有一個完整編碼區(qū)的基因序列，命名DenSIZ1．

2.2DenSIZ1核苷酸、氨基酸序列組成和理化性質(zhì)分析

通過NCBI網(wǎng)站的BLAST工具比較分析DenSIZ1的CDS序列，該片段與其他植物的SUMO ligase基因家族同源性較高．如與蓖麻Ricinuscommunis的SUMO ligase、水稻OryzasativaJaponicaGroup的Os05go125000、擬南芥的AtSIZ1的序列相似性都高達99%．DenSIZ1 cDNA序列全長3 422 bp，包含1個2 595 bp的開放閱讀框(ORF)，1個294 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)和1個533 bp的帶有加尾信號的3′非編碼區(qū)(3′UTR)(圖3)．由其推導DenSIZ1的氨基酸序列總長為864個氨基酸，理論相對分子量約為94.90×103，等電點pI為5.04，屬于不穩(wěn)定蛋白家族類，這些為DenSIZ1蛋白的提取、分離純化及植物介導的RNAi研究提供了基礎數(shù)據(jù)．

M: 250 bp DNA Ladder marker; 1: 3′RACE PCR product of GSP1 and 3′CDSⅢ as primers(2 511 bp); 2: PCR product of GSP2 and 3′CDSⅢ as priemrs(2 320 bp); 3: PCR product of GSP3 and 3′CDSⅢ as primers(2 304 bp).

圖1DenSIZ1 3′RACE PCR擴增
Figure 1 3′RACE PCR amplification ofDenSIZ1 gene

M: 250 bp DNA Ladder marker; 1～10:DenSIZ1 PCR products(2 615 bp).

圖2DenSIZ1全長基因PCR擴增
Figure 2 PCR amplification ofDenSIZ1 gene

2.3DenSIZ1蛋白的性質(zhì)

SIZ1蛋白屬于SUMO E3酶家族，將不同SUMO E3酶家族成員與DenSIZ1的氨基酸序列構(gòu)建進化樹進行同源性分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)DenSIZ1與AtSIZ1[4]同源性較高，親源性較近.DenSIZ1與PIAS家族聚類在一起，表明DenSIZ1可能屬于SUMO E3 ligase的PIAS家族蛋白，具有靶蛋白特異性及促進SUMOs與靶蛋白結(jié)合的特性．

黑體標記核苷酸為5′UTR及3′UTR序列

TMHMM在線分析軟件分析表明DenSIZ1多肽鏈中不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)．DictyOGlyc預測表明DenSIZ1只有1個位于第555位的絲氨酸糖基化位點．經(jīng)NetPhos2.0 Server 磷酸化位點分析結(jié)果表明DenSIZ1氨基酸序列共有53個磷酸化位點，均勻分布于整個多肽鏈中．DenSIZ1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測其主要包含隨機卷曲、α-螺旋和延伸鏈，分別占60.42%、18.63%、20.95%，散布于整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中．隨機卷曲與延伸鏈之和占整個二級結(jié)構(gòu)鏈的81%，表明DenSIZ1的功能結(jié)構(gòu)域主要在α-螺旋形成的區(qū)域．

Rattusnorvegucus:褐鼠；Musmusculus:小白鼠；Homosapens:智人；BosTaurus:黃牛；Gallusgallus:雞；Schizosaccharomycespombe:栗酒裂殖酵母；Arabidopsisthaliana:擬南芥；Ricinuscommuis:蓖麻;Dendrobium:石斛蘭；Xenopuslaevis:蟾蜍；Salmosalar：大西洋鮭；Saccharomycescerevisiae: 酵母

圖4 DenSIZ1蛋白的分子進化樹分析

Figure 4 The phylogenetic tree analysis of DenSIZ1 protein

通過Pfam在線分析，DenSIZ1存在3個功能結(jié)構(gòu)域，即SAP、PHD、zf-MIZ(圖5).SAP功能結(jié)構(gòu)域由第11～45位氨基酸形成，是某些酶具有特定結(jié)合DNA活性的重要功能域，推測其為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[5]．PHD功能域由第114～169位氨基酸組成，形成一個鋅指結(jié)構(gòu)，具有PHD結(jié)構(gòu)域的核蛋白參與染色質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄過程．第360～409位氨基酸形成zf-MIZ(MIZ/SP-RING zinc finger)保守結(jié)構(gòu)域．SUMO E3酶SP-RING結(jié)構(gòu)域功能是SUMO化酶所特有的，SP-RING Zn指結(jié)構(gòu)域結(jié)合上Ubc9(SUMO E2酶)與底物形成的復合物，提高底物SUMO化速率[6]．

圖5 DenSIZ1的功能結(jié)構(gòu)域分析

Figure 5 Functional domain analysis of DenSIZ1

SAP結(jié)構(gòu)域參與DNA轉(zhuǎn)錄、RNA加工等過程，PHD結(jié)構(gòu)域參與染色質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄過程．這2個功能域都需與染色體結(jié)合才能行使其功能，推測DenSIZ1蛋白可能定位于含有染色體的亞細胞結(jié)構(gòu)．而DenSIZ1與AtSIZ1具有高度同源的SAP和PHD結(jié)構(gòu)域，AtSIZ1定位于細胞核．推測DenSIZ1蛋白可能定位于細胞核或葉綠體．這些還有待實驗證實.

3 討論

SUMO化修飾作為蛋白翻譯后修飾的一種重要形式，是蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學功能的重要調(diào)節(jié)機制．基因翻譯后修飾作用對蛋白的功能具有重要影響，蛋白質(zhì)必須進行修飾，才能成為具有生理功能的活性蛋白[7]．本文預測，DenSIZ1只有1個糖基化位點，有53個磷酸化位點．對跨膜區(qū)的預測發(fā)現(xiàn)DenSIZ1沒有跨膜區(qū)，是一個非膜結(jié)合蛋白．蛋白行使功能部位可能是細胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、各細胞器和細胞核．通過WOLF PSORT預測進一步定位DenSIZ1可能分泌至細胞核，此預測與其同源蛋白AtSIZ1定位于細胞核的研究相同．

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3類SUMO E3酶：PIAS家族、RanBP2家族和Pc2家族[8]．PIAS家族和RanBP2家族都具有1個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對PIAS家族蛋白來說是必需的，PIAS家族蛋白的活化需要環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，而RanBP2家族蛋白則不需要[9]．對DenSIZ1蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)DenSIZ1可能具有2個重要的zf-MIZ鋅指環(huán)狀結(jié)構(gòu)和PHD鋅指環(huán)狀結(jié)構(gòu)，表明DenSIZ1可能屬于PIAS家族SUMO E3酶，但目前未知2個環(huán)狀結(jié)構(gòu)是否都對蛋白活化起作用．

利用生物信息學技術(shù)對目標靶基因進行結(jié)構(gòu)和功能預測成為一項重要的科研技術(shù)策略．SIZ1是SUMO化途徑中的重要SUMO E3酶，參與靶蛋白的選擇及靶蛋白的連接，在植物非生物應激反應和植物開花周期中起著重要調(diào)節(jié)作用．該研究從石斛蘭基因組中克隆到SIZ1基因，進行了詳細的生物信息學分析與預測，為進一步研究石斛蘭SIZ1基因的功能和完善植物SUMO化途徑的生理功能奠定理論基礎．

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Keywords：Dendrobium; SUMO E3 ligase; gene cloning; sequence analysis

【責任編輯 成 文】

CLONINGANDSEQUENCEANALYSISOFSIZ1GENEINDENDROBIUM

WANG Yaqin1,2*, ZHONG Kaixin1, YANG Chengwei2, LIANG Shan2

(1.School of Bioscience & Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China; 2.Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A SIZ1-like gene was firstly cloned fromDendrobiumcDNA library and named asDenSIZ1. Using the bioinformatics software, the physical and chemical properties, composition,secondary structure, tertiary structure, subcellular localization and functional structure domain were analysized and predicted. These results showed thatDenSIZ1 probably belongs to PIAS family member of SUMO E3 ligase and includes three important function domains of SAP, PHD and zf-MIZ. Moreover, it is located in cellular nucleus and has higher homology with PIAS family.

2010-12-20

國家自然科學基金項目(30970216)；863資助項目(024-D90661)；廣東省自然科學基金項目(07006553)；廣東省科技計劃項目(2007A020100001)

*通訊作者,yqwang@scut.edu.cn

1000-5463(2011)02-0119-05

Q785

A