酶法制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸

喬 路， 佟 偉 剛， 周 大 勇， 朱 蓓 薇

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.白城市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林 白城 137000）

0 引 言

鮑（Haliotis）是名貴的水產(chǎn)珍品，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。長(zhǎng)期以來，鮑的加工和食用主要以腹足為主，占鮑總重1／4左右的臟器大部分被丟棄，這不僅會(huì)造成環(huán)境污染，同時(shí)還是資源的極大浪費(fèi)。研究表明，皺紋盤鮑臟器中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%以上［1］，并含有豐富的精氨酸、谷氨酸、色氨酸等人體所需氨基酸和多種微量元素［2］，具有很大的利用價(jià)值。本研究以皺紋盤鮑臟器為原料，優(yōu)化了利用酶法制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸的條件，以期為鮑魚臟器的高值化利用提供新的理論依據(jù)。

1 試 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

鮑魚臟器：大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。試驗(yàn)所用鮑魚臟器干粉的化學(xué)組成：總蛋白57.17%，總糖16.36%，總脂11.5%，水分5.36%，灰分8.68%。

LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī)，沈陽(yáng)航天新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司；8050 超濾攪拌器，Millipore France；甲醛，大連醫(yī)藥集團(tuán)化玻公司；三氯乙酸，天津市光復(fù)精密化工研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮鮑魚臟器洗凈，勻漿，凍干至含水9%以下，粉碎，過20目篩后備用。

1.2.2 鮑魚臟器的蛋白酶酶解

分別用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解鮑魚臟器干粉，酶解條件見表1。產(chǎn)物用分子質(zhì)量10ku的超濾膜進(jìn)行超濾分離，取分子質(zhì)量小于10ku的肽組分（AVHs-I）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 3種酶的試驗(yàn)條件Tab.1 Experimental conditions for the three proteases

1.2.3 蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

中性蛋白酶單因素試驗(yàn)的基本條件為：酶加量2 500 U／g，反應(yīng)溫度50 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，pH 7.0，水解時(shí)間3h。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分別考察酶加量、水解溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH 和水解時(shí)間對(duì)水解度的影響。各因素 水 平 梯 度 分 別 為：酶 加 量2 000、2 500、3 000、3 500、4 000U／g；反應(yīng)溫度35、40、45、50、55 ℃；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、12%；pH 6.0、7.0、7.5、8.0、8.5；水解時(shí)間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h。水解完成后，在沸水浴中保持10min滅酶，采用甲醛滴定法測(cè)定水解度。研究各因素對(duì)于中性蛋白酶應(yīng)選取的大致范圍，并以此為基礎(chǔ)確定響應(yīng)面各個(gè)水平值，從而使得測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確、有效、實(shí)用。

1.2.3.2 響應(yīng)面分析

分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，將酶解溫度定為45 ℃，時(shí)間定為3h，以水解度為指標(biāo)，做酶加量、pH 值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三因素三水平中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)［3］。

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 化學(xué)組成的測(cè)定

蛋白質(zhì)的測(cè)定：微量凱式定氮法［4］。

總糖的測(cè)定：菲林試劑法［5］。

水分的測(cè)定：根據(jù)GB／T 5009.3—2003，采用直接干燥法。

脂肪的測(cè)定：索氏提取法［6］。

灰分測(cè)定：根據(jù)GB／T 5009.4—2003，采用馬弗爐灼燒法。

1.2.4.2 酶活力的測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定酶活力［7］。

1.2.4.3 水解度的測(cè)定［8］

采用甲醛滴定法［9］測(cè)定鮑魚臟器水解液中的酸溶氮的質(zhì)量。

總氮：凱氏定氮法。

水解度=酸溶氮的質(zhì)量／總氮質(zhì)量

1.2.4.4 肽得率的測(cè)定

采 用 三 氯 乙 酸（TCA）沉 淀 法［10-11］結(jié) 合

FoLin-酚法［12］測(cè)定肽得率。

肽得率= （m2-m1）／（m0-m1）

式中，m1為反應(yīng)前蛋白液中TCA 可溶性蛋白質(zhì)量，mg；m2為蛋白酶解液中TCA 可溶性蛋白質(zhì)量，mg；m0為總蛋白質(zhì)量，mg。

1.2.4.5 谷氨酸等鮮味氨基酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

走過小橋，穿過公路，穿過綠地，看著他們?nèi)松硎殖C健地翻越鐵柵欄，特別是泰森，黑熊一樣笨重的身軀翻越柵欄時(shí)像山羊一樣輕捷靈敏。進(jìn)院子后，他們?cè)谝粯堑拇箝T口鼓搗了一會(huì)兒，門便悄無聲息的打開了。看著他們幽靈一般魚貫而入，門悄無聲息的掩上，我突然有了決定——趕快跑！

由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析測(cè)試中心色譜實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.5 感官評(píng)定分析

采用排序檢驗(yàn)法［13］測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的選擇

2.1.1 鮑魚臟器水解產(chǎn)物的水解度及肽得率

根據(jù)表1的試驗(yàn)條件進(jìn)行酶解，各酶解產(chǎn)物的主要化學(xué)組成以及水解度和肽得率結(jié)果如表2所示。

表2 鮑魚臟器3種蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度及肽得率信息Tab.2 Hydrolysis degree and peptide yield derived from abalone viscera digested with the three proteases

從表2中可以看出，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解度及肽得率在3個(gè)酶解產(chǎn)物中均屬最高，其次是木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物。根據(jù)表中數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物的水解度高，其肽得率也高，二者呈正相關(guān)。

2.1.2 鮑魚臟器水解產(chǎn)物的鮮味氨基酸

從表3中可以看出，原料中富含天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸等3種鮮味氨基酸。原料經(jīng)水解超濾后，各產(chǎn)物的鮮味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)稍有增加。中性蛋白酶酶解產(chǎn)物鮮味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于來源于其他兩個(gè)蛋白酶的酶解產(chǎn)物。

表3 鮑魚原料和3種酶解產(chǎn)物AVHs-I的呈味氨基酸組成Tab.3 Flavor amino acid contents of the abalone viscera and the three AVHs-I derived from different proteases

2.1.3 排序檢驗(yàn)感官評(píng)價(jià)結(jié)果

本試驗(yàn)將中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制備的呈味肽及呈味氨基酸按照排序檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

對(duì)表4進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并進(jìn)行樣品秩次與秩和分析。使用Friedman檢驗(yàn)，求出統(tǒng)計(jì)量F：

式中，J，品評(píng)人數(shù)；P，樣品數(shù)；R1，R2，…，RP，每種樣品的秩和。

表4 評(píng)價(jià)員的評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.4 Evaluation results of evaluators

用F 與Friedman 秩和檢驗(yàn)近似臨界值比較［15］，計(jì)算所得F 值大于表中（顯著水平α=0.01）對(duì)應(yīng)的臨界值，即9.75＞9。從而得出結(jié)論：中性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有更好的口感效果。

崔春等［16］的報(bào)道指出，水解度較低時(shí)酶解液無明顯風(fēng)味或以特征苦味為主，如果提高水解度會(huì)將大部分蛋白質(zhì)降解為氨基酸和小分子肽，酶解液會(huì)呈現(xiàn)出典型的鮮味。同時(shí)，蛋白酶的專一性水解與呈味也有很大關(guān)系，若水解液以親水性肽為主則呈現(xiàn)鮮味［17］。

中性蛋白酶酶解鮑魚臟器所獲酶解產(chǎn)物的水解度及鮮味氨基酸含量均最高，而且其口感也最好，因此該酶被選為工具酶進(jìn)行酶解條件的研究。

2.2 工具酶酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)利用中性蛋白酶作為工具酶，以水解度為指標(biāo)，得到的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。中性蛋白酶在單因素試驗(yàn)環(huán)節(jié)確定的最適酶加量為3 000U／g，最適酶解溫度為45℃，最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，最適pH 為7.5，最適酶解時(shí)間為3h。

2.2.2 響應(yīng)面分析

以水解溫度、底物濃度和pH 為自變量，以水解度為因變量。用Minitab15軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Experimental results of response surface methodology

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入軟件可得回歸模型方程：

圖1 中性蛋白酶水解鮑魚臟器的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experiment

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。模型整體為顯著水平，表明回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)吻合良好。由響應(yīng)面結(jié)果的方差分析可知，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的，交互項(xiàng)作用影響不顯著，故交互項(xiàng)可以省略，也可以看出各具體試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

通過降維分析方法將多元問題轉(zhuǎn)化為一元或二元問題，便于分析單因素及雙因素與蛋白水解度的效應(yīng)關(guān)系，并用圖形表示，可獲得形象圖像。將任一因素固定在“0”水平，得到另外兩個(gè)因素的交互影響結(jié)果，見響應(yīng)曲面圖2。

表6 回歸方程的方差分析Tab.6 Analysis of variance of regression equation

圖2 3個(gè)因素對(duì)酶解效果的交互影響Fig.2 Interaction influences of three factors on enzymolysis

比較3組圖可知，影響酶解效果的顯著性大小順序依次為溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH。

對(duì)擬合模型進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化，得最優(yōu)酶解條件X1=0.160 9、X2=0.115 8、X3=-0.689 3，即溫度46.0 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.12%，pH 7.8，酶加量3 000U／g，作用時(shí)間3h。在此條件下，理論水解度為29.81%，實(shí)測(cè)水解度為29.98%。

3 結(jié) 論

中性蛋白酶是制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸的最佳工具酶，其酶解產(chǎn)物的水解度及肽得率分別為22.59%和44.96%，其天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為114.77、142.75 和62.83mg／g。排序檢驗(yàn)感官評(píng)定法確定中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的口感最好。

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定中性蛋白酶的最佳酶解工藝條件為：溫度46.0 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.12%，pH 7.84，加酶量3 000U／g，反應(yīng)時(shí)間3h。在此條件下理論水解度為29.81%，實(shí)測(cè)水解度為29.98%。

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