附子多糖預(yù)防高膽固醇血癥的作用及其對(duì)肝臟CYP7α-1表達(dá)的影響*

周 芹， 段曉云， 陸立鶴， 肖 穎， 黃雄慶△， 吳偉康

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院麻醉科,2中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 廣州 510080)

附子多糖預(yù)防高膽固醇血癥的作用及其對(duì)肝臟CYP7α-1表達(dá)的影響*

周 芹1， 段曉云1， 陸立鶴2， 肖 穎1， 黃雄慶1△， 吳偉康2

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院麻醉科,2中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 廣州 510080)

目的： 探討附子多糖(FPS)預(yù)防高膽固醇血癥的作用及其對(duì)肝臟膽固醇7α-羥化酶(CYP7α-1)表達(dá)的影響。方法SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體重100 g，隨機(jī)分為正常組(control)、高膽固醇組(HC)和HC+附子多糖(HC+FPS)低、中、高3個(gè)劑量組，每組10只，分別給予正常、高膽固醇及高膽固醇加附子多糖(224、448和896mg·kg-1·d-1)飲食，持續(xù)2周，檢測各組的血脂水平；觀察control組、HC組和HC+FPS(224 mg·kg-1·d-1)組大鼠的體重、進(jìn)食量和糞便量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取3組大鼠的肝臟行HE染色；并檢測3組大鼠肝臟羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶mRNA水平、CYP7α-1 mRNA和蛋白水平以及糞便總膽汁酸含量等方面的改變。結(jié)果附子多糖能顯著抑制高膽固醇血癥大鼠血清中總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平(Plt;0.05)；HC+FPS組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性較HC組輕微；real-time PCR和Western blotting結(jié)果顯示附子多糖能顯著上調(diào)高膽固醇大鼠肝臟CYP7α-1 mRNA水平和蛋白表達(dá)并明顯降低HMG-CoA還原酶的mRNA水平(Plt;0.01)；HC組大鼠糞便中膽汁酸的含量增多而HC+FPS組進(jìn)一步增加(Plt;0.05)。結(jié)論附子多糖具有明顯的降血膽固醇作用，其機(jī)制與上調(diào)CYP7α-1 mRNA及蛋白水平和下調(diào)大鼠肝臟HMG-CoA還原酶mRNA水平有關(guān)。

附子多糖; 高膽固醇血癥; 膽固醇 7α-羥化酶; 羥甲基戊二酰輔酶A還原酶

高脂血癥是指血漿或血清中一種或多種脂質(zhì)(主要指膽固醇和甘油三酯)的含量超過正常高限時(shí)的病癥。早在1975年Keys[1]就發(fā)現(xiàn)血漿中膽固醇和低密度脂蛋白濃度的增高將明顯增加動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生率，而冠心病的死亡率與血脂膽固醇水平也呈正相關(guān)關(guān)系[2]。目前市場上降膽固醇的西藥大多價(jià)格昂貴且都存在一定的不良反應(yīng)[3,4]，近年來中草藥的降脂作用得到了大家廣泛的重視和應(yīng)用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)室成功從四逆湯的主藥附子中提取了水溶性好、無毒的葡聚糖成分附子多糖(Aconitituber polysaccharides,Fuzi polysaccharides,FPS)，并申請(qǐng)了專利[7]；對(duì)它的系列研究表明其具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗心衰以及肝細(xì)胞脹亡等作用[8,9]。本研究深入探討其預(yù)防大鼠高膽固醇血癥的作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1附子多糖 由中山大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室提取并申請(qǐng)專利(專利號(hào)200610034083.1)。

1.2飼料 高膽固醇飲食配方為2％膽固醇，0.5％膽酸鹽與基礎(chǔ)飼料混合。

1.3主要試劑和儀器 3700M071型代謝籠購自Tecniplast；總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白試劑盒購于上海榮盛生物技術(shù)公司； Trizol reagent購自Invitrogen，SYBR Green I熒光染料購于Roch，其它主要試劑購于Fermentas；兔抗鼠膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7α-1)抗體和辣根過氧化物共軛的羊抗兔的Ⅱ抗購于Santa Cruz。

1.4動(dòng)物分組和飼養(yǎng) SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只，6-8周齡，體重(100±13)g，于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，合格證號(hào)為SCXK(粵)2004-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：正常組(control)、高膽固醇組(high-cholesterol diet,HC)和附子多糖低、中、高劑量組，每組10只，采用代謝籠單籠單只喂養(yǎng)。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料，高膽固醇組和附子多糖組飼喂高膽固醇飲食，其中附子多糖低、中、高組分別按224、448和896 mg·kg-1·d-1灌胃附子多糖生理鹽水溶液10 mL·kg-1；正常組和高膽固醇組灌服等體積生理鹽水，給予自由飲水，實(shí)驗(yàn)持續(xù)2周。于第14 d晚上撤去食物但不禁水，第2 d早上8時(shí)給予戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后摘除眼球取血1 mL，血液標(biāo)本于1 500 r·min-1，離心15 min，分離血清。每天精確計(jì)算正常組、高膽固醇組及附子多糖(224 mg·kg-1·d-1)組中每只大鼠的進(jìn)食量、糞便量并每隔2 d稱重1次。最后處死動(dòng)物并迅速取出肝臟用生理鹽水洗凈濾紙吸干后分成2份，1份立即放入10％甲醛中固定，石蠟包埋;另1份立即液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2測定指標(biāo)及方法

2.1血脂測定 總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein,HDL)用上海榮盛生物技術(shù)公司試劑盒測定。

2.2大鼠肝臟的HE染色 將石蠟包埋的大鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色。

2.3大鼠肝臟組織的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime PCR) 提取總RNA后進(jìn)行洗滌和濃度測定，將總RNA和引物合成cDNA，最后用SYBR Green熒光染料法定量PCR，其中選擇的引物結(jié)果及相關(guān)條件如下：

羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶上游引物5’-CTT GAC GCT CTG GTG GAA TG-3’，下游引物5’-AGT TGG AAG CAC GGA CATA -3’，擴(kuò)增片段106 bp；反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃60 s，55 ℃45 s， 10個(gè)循環(huán)。

CYP7α-1上游引物 5’-ATG ACC TGC CGG TAC TAG ACA-3’，下游引物5’-TGA AGT CCT CCT TAG CTG TGC-3’，擴(kuò)增片段90 bp；反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。

2.4大鼠肝臟CYP7α-1蛋白檢測 提取大鼠肝臟細(xì)胞膜蛋白后使用核酸蛋白測定儀測定提取的蛋白濃度；分別配、灌制10％分離膠和5％積層膠并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，加入1∶800濃度TBS/T稀釋的CYP7α-1抗體孵育(4 ℃搖床輕搖過夜)，與辣根過氧化物共軛的驢抗山羊Ⅱ抗(1∶2 000)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，最后進(jìn)行顯影、檢測。

2.5糞便總膽汁酸的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3 d，代謝籠收集大鼠糞便稱重之后保存，收集72 h糞便 ，56 ℃烘干至試樣恒重為止。每只大鼠均隨機(jī)取試樣50 mg，參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行測定，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作過程試劑的配制及大鼠的排糞量折算成72 h大鼠糞便排出膽汁酸的總量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1大鼠的血脂變化

HC組大鼠的血清膽固醇和低密度脂蛋白較對(duì)照組明顯增加(Plt;0.05)。而HC+FPS各組均能顯著抑制高膽固醇飲食導(dǎo)致的血清總膽固醇和低密度脂蛋白升高(Plt;0.05)；而對(duì)甘油三酯和高密度脂蛋白無顯著影響，見表1。

表1 FPS不同劑量組對(duì)血脂的影響

2附子多糖對(duì)大鼠進(jìn)食量、糞便量和體重的影響

各組大鼠間的體重、攝食量及糞便排出量均無顯著差異，提示FPS對(duì)大鼠的體重、攝食量和糞便排泄量均無影響。

3大鼠肝臟組織HE染色

光學(xué)顯微鏡下可見：HC組大鼠的肝臟細(xì)胞脂肪變性改變較為明顯，而HC+FPS組改變較HC組輕微,見圖1。

Figure 1.Pathological changes of liver(HE staining,×400) .A:control;B:HC;C:HC+FPS(224 mg·kg-1·d-1).

4肝臟HMG-CoA還原酶mRNA水平

HC組中肝臟HMG-CoA還原酶的mRNA水平較對(duì)照組明顯增加(Plt;0.01)；HC+FPS組比HC組明顯下降(Plt;0.01)而與對(duì)照組無顯著差異，見表2。

5肝臟CYP7α-1的mRNA水平和蛋白表達(dá)

與HC組相比，HC+FPS組CYP7 α-1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(Plt;0.01)；HC組與對(duì)照組比無顯著差異，見表2、圖2。

表2 FPS對(duì)大鼠CYP7α-1和HMG-CoA還原酶 mRNA表達(dá)的影響

Figure 2.Effect of FPS on hepatic CYP7α-1 protein expression in rats determined by Western blotting.±s.n=10.**Plt;0.01 vs HC.

6糞便總膽汁酸的測定結(jié)果

HC組大鼠的糞便中膽汁酸的含量明顯增多，而HC+FPS組能進(jìn)一步增加糞便中膽汁酸的含量(Plt;0.05),見圖3。

Figure 3.Effect of FPS on fecal bile acid content in the last threedays of the study period±s.n=10.#Plt;0.05 vs control;*Plt;0.05 vs HC.

討 論

四逆湯是醫(yī)圣張仲景《傷寒論》中所創(chuàng)經(jīng)典名方，以回陽救逆的功效而著名。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)四逆湯具有減輕家兔動(dòng)脈粥樣硬化，降低血脂的作用[11,12]。方中君藥附子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛莨科多年生草本植物烏頭子根的加工品,在心血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌等方面都具有重要的藥理作用。本研究發(fā)現(xiàn)FPS在224 mg·kg-1·d-1這個(gè)劑量已經(jīng)明顯抑制飼喂高膽固醇飲食大鼠血清TC和LDL-C水平的升高。本課題組前期對(duì)小鼠的研究提示：FPS(160 mg·kg-1·d-1)2周能顯著抑制高脂飲食導(dǎo)致的血清甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白的升高，且降血清膽固醇和低密度脂蛋白的作用與氟伐他汀相當(dāng)；本實(shí)驗(yàn)中FPS 224 mg·kg-1·d-1的劑量與FPS 160 mg·kg-1·d-1劑量相當(dāng)，其降膽固醇效應(yīng)也與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)采用3700M071型代謝籠單籠單養(yǎng)，喂食、飲水以及糞便、尿液的收集互不干擾，保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。對(duì)照組、HC組、HC+FPS(224 mg·kg-1·d-1)組大鼠的攝食量、糞便排泄量及體重的增長均無顯著差異，證明FPS引起TC和LDL-C的水平下降與食欲、進(jìn)食及排泄無關(guān)。肝組織HE染色可見HC組大鼠的肝臟細(xì)胞脂肪變性改變明顯，而HC+FPS組已有明顯好轉(zhuǎn)。

內(nèi)源性膽固醇合成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，肝臟是其合成的主要場所。其中HMG-CoA還原酶是一個(gè)關(guān)鍵的限速酶，其濃度高低直接影響膽固醇合成的數(shù)量。本研究結(jié)果顯示：FPS抑制HMG-CoA 還原酶mRNA表達(dá)，表明FPS可通過抑制HMG-CoA還原酶而使內(nèi)源性膽固醇合成減少，與他汀類降脂藥的作用類似[13,14]。

大量研究表明膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化為膽汁酸是其主要去路。CYP7α-1起著關(guān)鍵作用,其數(shù)量或者活性增加可以加快肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)換成膽汁酸[15]；因此，測定CYP7α-1的水平以及糞便中膽汁酸的含量有助于了解機(jī)體膽固醇代謝的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HC+FPS組CYP7α-1 mRNA的表達(dá)和蛋白水平均顯著增加；糞便總膽汁酸的排出亦顯著增加。提示FPS能夠增強(qiáng)CYP7α-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，加快肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)換成膽汁酸；而且能增加糞便中膽汁酸的排出，最終使體內(nèi)過多的膽固醇排出體外。

本研究提示：FPS具有明顯的降血膽固醇作用，其機(jī)制與FPS增加CYP7α-1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)有關(guān)，從而促進(jìn)了體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，隨糞便排出體外；同時(shí)FPS還能抑制HMG-CoA還原酶mRNA表達(dá)，抑制內(nèi)源性膽固醇合成，使血中膽固醇濃度下降。由于FPS明確的降脂和免疫調(diào)節(jié)作用，幾乎無任何毒、副作用，極有可能成為抗動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的理想藥物。

[1]Keys A.Coronary heart disease-the global picture[J].Atherosclerosis,1975,22(2):149-192.

[2]Steinberg D.Lipoprotein and the pathogenesis of atherosclerosis[J].Circulation，1987,76(3):508-514.

[3]駱雷鳴，劉樹國.他汀類藥物安全性[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2001，3(4):215-221.

[4]Baigent C,Keech A,Kearney PM,et al.Efficacy and safety of cholesterol- lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90 056 participants in 14 randomised trials of statins[J].Lancet ，2005，366(9493):1267-1278.

[5]Inoue N,Yamano N,Sakata K,et al.The sulfate polysaccharide porphyran reduces apoliportein B100 secretion and lipid synthesis in HepG2 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem ，2009，73(2):447-449.

[6]Ormrod DJ，Holmes CC，Miller TE.Dietary chitosan inhibits hypercholesterolaemia and atherogenesis in the apolipoprotein E deficient mouse model of atherosclerosis[J].Atherosclerosis，1998,138(2):329-334.

[7]Zhao C,Li M,Luo Y,et al.Isolation and structural characterization of an immunostimulating polysaccharide from fuzi,Aconitumcarmichaeli[J].Carbohydrate Res，2006，341(4):485-491.

[8]于 樂，吳偉康.附子多糖對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型葡萄糖攝取的影響[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5(7):11-13.

[9]Lin S,Liu K,Wu W,et al.Study on pretreatment of FPS-1 in rats with hepatic ischemia-reperfusion injury[J].Am J Chin Med，2009，37(2):323-337.

[10]Wilson TA，Nicolosi RJ，Rogers EJ，et al.Studies of cholesterol and bile acid metabolism,and early atherogenesis in hamsters fed GT16-239,a novel bile acid sequestrant (BAS)[J].Atherosclerosis，1998，140(2):315-324.

[11]黑子清,吳偉康，孫惠蘭，等.四逆湯對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化的形成及血管壁神經(jīng)酰胺含量的影響[J].中國病理生理雜志，2003，19(3):345-347.

[12]黃河清，吳偉康，羅漢川.四逆湯與維生素E抗血管內(nèi)皮功能氧化損傷及防治家兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的比較研究[J].中國病理生理雜志，2001,17 (2):154-157.

[13]DeBose-Boyd RA.Feedback regulation of cholesterol synthesis: sterolaccelerated ubiquitination and degradation of HMG-CoA reductase[J].Cell Res，2008,18 (6) : 609 -621.

[14]Brookes ZL,McGown CC,Reilly CS.Statins for all: the new premed?[J].Br J Anaesth，2009,103(1)：99-107.

[15]Garcia-Mediavilla V,Villares C,Culebras JM，et al.Effects of dietary beta-cyclodextrin in hypercholesterolaemic rats[J].Pharmacol Toxicol，2003,92(2)：94-99.

在成骨細(xì)胞分化過程中調(diào)節(jié)Osterix轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和腫瘤壞死因子

活性的同源異形盒蛋白Prx1的表達(dá)

腫瘤壞死因子 (TNF-α)具有促使骨質(zhì)疏松發(fā)生和抑制骨形成的作用，是骨節(jié)炎癥中導(dǎo)致骨骼損傷的重要因子。成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)來源于多能間充質(zhì)細(xì)胞系，是骨形成的主要功能細(xì)胞，其按一定的路徑分化為成熟骨細(xì)胞。Osterix(Osx,SP7)是一種OB分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子。有實(shí)驗(yàn)證明如果機(jī)體缺乏該轉(zhuǎn)錄因子會(huì)導(dǎo)致骨骼軟骨化。美國科學(xué)家的研究曾經(jīng)報(bào)道過一種位于Osx啟動(dòng)子內(nèi)的TNF抑制元件，這種抑制元件可以用于分離核蛋白，從而介導(dǎo)TNF-α發(fā)揮抑制OB分化的作用。用TNF-α處理前成骨細(xì)胞，然后將該細(xì)胞中的核提取物與TNF抑制元件共同培養(yǎng)進(jìn)行蛋白pull-down實(shí)驗(yàn)，之后通過質(zhì)譜分析法檢測分析獲得的胰蛋白酶片段。利用染色質(zhì)免疫共沉淀法證實(shí)出8種結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的存在。PCR結(jié)果顯示，同源異形盒蛋白(homeobox protein，Prx1)在原始基質(zhì)細(xì)胞(即間充質(zhì)干細(xì)胞，MSCs)、C3H10T1/2細(xì)胞和MC3T3前成骨細(xì)胞中表達(dá)。以前的研究已確認(rèn)Prx1是一種在胚胎肢芽形成和骨骼塑型中起重要作用的蛋白。TNF-α可以促使Prx1表達(dá)過程中轉(zhuǎn)錄形成的mRNA數(shù)量增長14倍，同時(shí)它還加速Prx1在MC3T3細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)積聚以及在體內(nèi)骨膜內(nèi)層細(xì)胞和小梁內(nèi)層細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。Prx1瞬間表達(dá)抑制了Osx和RUNX2基因的轉(zhuǎn)錄，其同源異構(gòu)體Prx1b即Prx2的表達(dá)降低了Osx和RUNX2 mRNA的形成，也抑制了成骨細(xì)胞的分化。在對(duì)Prx1特異的小干擾RNA(siRNA)作用下Prx1表達(dá)沉默，消除了TNF-α對(duì)Osx mRNA的抑制作用，從而加速Osx的基礎(chǔ)表達(dá)。經(jīng)電泳遷移率檢測顯示Prx1b是首選的與Osx啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白。以上研究結(jié)果證實(shí)，Prx1是參與TNF-α抑制Osx表達(dá)和成骨祖細(xì)胞分化的固有介質(zhì)。TNF-α激活Prx1，從而抑制關(guān)節(jié)炎、女性更年期和衰老等情況下骨的形成。

J Bone Mineral Res,2011,26(1):209-219 (李麗娜)

EffectsofAconitituberpolysaccharidesonhypercholesterolemiaandhepaticcholesterol7α-hydroxylaseexpressioninrats

ZHOU Qin1,DUAN Xiao-yun1,LU Li-he2,XIAO Ying1,HUANG Xiong-qing1,WU Wei-kang2

(1DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:hxiongqing@21cn.com)

AIM: To investigate the effects of polysaccharides isolated fromAconitituber (Fuzi polysaccharides,FPS) on the prevention of hypercholesterolemia induced by high-cholesterol diet and the expression of hepatic cholesterol 7α-hydroxylase (cytochrome P450 7α-1,CYP7α-1) in rats.METHODSFifty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups.The rats were fed with normal diet (control group),high-cholesterol diet (HC group) or high-cholesterol diet plus FPS (224,448 or 896 mg·kg-1·d-1,FPS group) for 2 weeks.The serum lipid level,body weight,food-intake and fecal amount were measured at week 2.The pathological changes of the liver were observed with HE staining.The mRNA expression of hydroxy methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase and CYP7α-1,the protein level of CYP7α-1,and fecal bile acid were also detected at week 2.RESULTSFPS significantly inhibited high-cholesterol diet-induced elevation of serum total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) (Plt;0.05).HE staining showed that FPS attenuated fatty degeneration in liver.Real-time PCR analysis showed that FPS significantly up-regulated the mRNA expression of CYP7α-1,but down-regulated the mRNA expression of HMG-CoA reductase (Plt;0.01).The protein level of CYP7α-1 was higher in FPS group than that in HC group (Plt;0.01).The level of fecal bile acid in HC-treated rats was higher than that in the control rats,and FPS stimulated the excretion of fecal bile acid (Plt;0.05).CONCLUSIONFPS significantly reduces serum cholesterol levels,which is associated with the up-regulation of hepatic CYP7α-1 expression and down-regulation of hepatic HMG-CoA reductase expression.

Aconitituber polysaccharides; Hypercholesterolemia; Cholesterol 7α-hydroxylase; Hydroxymethylglutaryl CoA reductases

1000-4718(2011)05-0991-05

R287

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.030

2011-01-01

2011-03-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30070930)

△通訊作者 Tel:020-87755766-8273；E-mail:hxiongqing@21cn.com