武漢漢族新生兒中肺表面活性物質蛋白D基因多態(tài)性及其與支氣管肺發(fā)育不良相關性分析*

周玉容， 常立文， 李文斌， 劉 偉， 曾凌空， 張 佳， 單瑞艷， 潘 睿

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科,湖北 武漢 430030)

武漢漢族新生兒中肺表面活性物質蛋白D基因多態(tài)性及其與支氣管肺發(fā)育不良相關性分析*

周玉容， 常立文△， 李文斌， 劉 偉， 曾凌空， 張 佳， 單瑞艷， 潘 睿

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科,湖北 武漢 430030)

目的： 研究武漢漢族新生兒中肺表面活性物質蛋白D(SP-D)基因多態(tài)性及其與支氣管肺發(fā)育不良(BPD)易感性的相關關系。方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)對218例武漢漢族新生兒SP-D相關位點進行基因型檢測,同時進行基因測序驗證結果。結果SP-DMet11Thr三種基因型TT、TC、CC頻率分別為10.5％、49.1％、40.4％，等位基因T和C頻率分別為35.1％和64.9％。SP-DAla160Thr三種基因型GG、GA、AA頻率分別為54.6％、39.4％、6.0％，等位基因G和A頻率分別為74.3％和25.7％。與對照組比，SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性與BPD發(fā)生率無明顯關聯(lián)(Pgt;0.05)。結論SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率存在種族差異性；SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性與BPD發(fā)生率無明顯關聯(lián)。

肺表面活性物質蛋白D； 等位基因； 基因型； 基因多態(tài)性； 支氣管肺發(fā)育不良

肺表面活性物質(pulmonary surfactant,PS)分布于肺泡液體分子層表面，具有降低肺泡表面張力防止呼氣時肺泡塌陷的作用。肺表面活性物質由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，它由磷脂和肺表面活性蛋白(surfactant proteins，SPs)組成。肺表面活性物質蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。其中SP-D屬于C型凝集素家族，同SP-A一樣是肺組織天然免疫的重要組成部分，而且它可以調節(jié)肺的炎癥過程[1]。SP-D除了在肺部炎癥和感染過程中起重要作用外，它還參與了肺表面蛋白的調節(jié)過程[2]。鑒于SP-D在維持肺組織功能方面的作用，它是研究新生兒肺疾病很好的候選基因[3]。SP-D基因研究得較多的是氨基酸殘基11密碼子(SP-DMet11Thr)和氨基酸殘基160密碼子(SP-DAla160Thr)的多態(tài)性[4]。SP-DMet11Thr 多態(tài)性與血清SP-D水平相關且T等位基因與較高的SP-D水平相關，SP-D水平80％由遺傳因素決定，Met11Thr多態(tài)性在其中起了一半決定作用[5]。SP-D外顯子5上基因多態(tài)性位點SP-DAla160Thr可導致SP-D氨基酸的改變，最新研究證明它的多態(tài)性還與潰瘍性結腸炎相關[6]。

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是長時間機械通氣早產兒的常見病因。近年來隨著早產兒存活率升高，BPD發(fā)病率呈上升趨勢。BPD是一種多因素疾病，其本質是在遺傳易感性的基礎上,氧中毒、氣壓傷、容量傷以及感染或炎癥等各種不利因素對發(fā)育不成熟的肺組織所導致的損傷,及其異常修復[7，8]。本研究以武漢漢族新生兒為研究對象，探討了武漢新生兒SP-D等位基因頻率分布。同時采用隨機病例-對照研究方法探討了SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性與BPD發(fā)生的關系。

材 料 和 方 法

1研究對象

選擇2008年7月至2010年5月就診同濟醫(yī)院的武漢地區(qū)漢族新生兒218例，其中男138例，女80例。所有符合BPD診斷[8]患兒共32例(男22例，女10例)選為病例組。BPD最重要的流行病因素是小胎齡和低出生體重[9]，我們對BPD胎齡和出生體重進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)胎齡lt;35周，出生體重均在2 kg以下。因此我們以胎齡﹤35周，出生體重﹤2 kg非BPD患兒64例為對照組(男48例，女16例)，并排除致死性先天畸形、嚴重的先天性心臟病等疾病。另外對照組存活均≥28 d。本研究由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準并獲得研究對象父母的知情同意。

2方法

2.1標本采集及基因組DNA抽提 抽取EDTA或肝素抗凝血0.5 mL，-20 ℃保存，用以提取基因組DNA。DNA抽提采取傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法。抽提步驟如下：凍存血自然解凍后加等量磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，3 000 r·min-1離心15 min;棄上清，加細胞裂碎液150 μL，37 ℃水浴60 min后加20％十二烷基硫酸鈉(SDS)25 μL和蛋白酶K 20 μL，37 ℃水浴過夜；次日取消化的細胞液按3∶1加酚氯仿異戊醇混勻，3 000 r·min-1離心10 min；酚氯仿異戊醇重復抽提1次；取上層加冰無水乙醇800 μL和醋酸鈉15 μL使DNA沉淀，70％乙醇洗滌后加TE緩沖液(Tris-EDTA)20 μL溶解DNA；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和基因測序 采用PCR技術，引物設計按文獻[10]。引物對中設計了錯配堿基(下劃線標出，見表1)，用以導入限制性內切酶識別位點。PCR反應體系20 μL，含10 μL 2×PCR PLUS MIX(DBI)，1.2 μL DNA模板，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共45個循環(huán)。72 ℃終末循環(huán)10 min。PCR擴增產物6 μL分別用FspⅠ(Toyobo)DraⅢ(NEB)酶切，反應體系15 μL，含F(xiàn)spⅠ、DraⅢ酶各4 U、5 U，37 ℃消化過夜。取5 μL酶消化產物和3 μL 6×上樣緩沖液進行瓊脂糖凝膠(濃度3％)電泳分離，紫外光下觀察并照相。參照DNA分子量標準(TaKaRa DL500 DNA marker)根據電泳條帶位置判斷基因型。上述PCR擴增產物隨機抽取部分送華大基因進行測序驗證，測序引物由華大基因設計，見表1。

表1 SP-D引物序列、限制性內切酶和酶切后片段長度及測序引物

3統(tǒng)計學處理

通過基因型頻率計算等位基因頻率，以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性。武漢新生兒基因型以及基因頻率分布的比較采用Pearson2檢驗。BPD組與對照組基因型及等位基因頻率比較分別用Fisher確切概率法。Plt;0.05 為顯著差異。Hardy-Wenberg平衡檢驗、基因頻率、等位基因頻率比較用Popgene 1.31統(tǒng)計軟件進行分析。其它數據分析采用 SPSS 11.5 for Windows 統(tǒng)計軟件。

結 果

1SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型

SP-DMet11Thr基因經PCR擴增產物大小為139 bp。經FspⅠ酶切后產生3種基因型，其基因型和對應酶切后長度為: CC(139 bp)、TC (107 bp、139 bp)和 TT(107 bp)。SP-DAla160Thr基因經PCR擴增產物大小為161 bp。經DraⅢ酶切后產生 3 種基因型，其基因型和對應酶切后長度為： GG(161 bp)、GA(132 bp、161 bp)、AA(132 bp)。PCR-RFLP檢測SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型結果與直接DNA測序結果完全吻合。

2武漢漢族新生兒SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型及等位基因頻率分布

選擇2008年7月至2010年5月就診同濟醫(yī)院的武漢地區(qū)漢族新生兒218例進行基因型的檢測。經Hardy-Weinberg平衡檢驗人群基因型達到遺傳平衡(Pgt;0.05)，具有群體代表性。SP-DMet11Thr三種基因型TT、TC、CC頻率分別為10.5 ％、49.1 ％、40.4 ％，等位基因T頻率為35.1 ％，等位基因C頻率為64.9 ％。SP-DAla160Thr三種基因型GG、GA、AA頻率分別為54.6 ％、39.4 ％、6.0 ％，等位基因G頻率74.3 ％，等位基因A頻率25.7 ％。

3不同國家地區(qū)SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性分布的比較

我們比較了不同國家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率。SP-DMet11Thr等位基因T頻率德國人為62.2 ％[4]，墨西哥人為61.0 ％[11]，日本人為41.2 ％[6]，漢族新生兒(本例對照)為34.0 ％。SP-DAla160Thr等位基因G在德國人為40.0 ％[4]，墨西哥人為60.0％[11]，日本人為68.4 ％[6]，而中國人為80.0 ％。不同國家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型見表2。從表2可見本研究對照組基因型頻率與日本人較接近。武漢新生兒與其他3種群基因型及等位基因頻率Pearson2檢驗顯示：武漢新生兒等位基因頻率與德國人、墨西哥人及日本人相比有顯著差異(Plt;0.05)；武漢新生兒基因型頻率與德國人和墨西哥人相比有顯著差異(Plt;0.05)，與日本人比差異不明顯(Pgt;0.05)。

4SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多態(tài)性與BPD發(fā)生的關系

BPD與對照組在性別構成、胎齡、出生體重等方面無顯著差異(Pgt;0.05)。SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型頻率和等位基因頻率在BPD和對照組中差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，見表3。

表3 BPD組和對照組SP-D Met11Thr 和SP-D Ala160Thr基因型及等位基因頻率分布

討 論

編碼SP-D的基因位于人類10號染色體的長臂q22.2-23.1區(qū)域，編碼SPA的基因也位于10號染色體長臂上。本文研究的多態(tài)性位點SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr在SP-D氨基酸末端和膠原結合區(qū)域。

我們對不同國家地區(qū)SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性的比較結果，進一步證實SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率存在種族差異性。大部分關于SP-D基因多態(tài)性與疾病的相關性主要在肺部疾病方面，尤其是肺部感染。眾多嚴重慢性和炎癥性肺部疾病存在SP-D血清水平升高現(xiàn)象，如間質性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、肺泡蛋白沉積癥、嗜酸性肺炎、急性呼吸窘迫綜合癥和囊性纖維化等[10,12]。已證實SP-DThr11等位基因是結核病的易感基因[13]，在此位點上的另一個等位基因SP-DMet11與嚴重呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎相關[11]。研究SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性種族差異性有利于了解某些疾病(尤其是SP-D相關性疾病)在某些種族中的易感性，從而有利于采取針對性的預防措施并最終找到治療方法(如基因治療,其已在積極研究中[14])。

而關于SP-D基因多態(tài)性與BPD關聯(lián)研究較少，目前國內尚無此類報道。國外有家系研究顯示單倍體型SPD-160(G)SPA2(1A2)和SPD-11(C)160(G)SPA2(1A2)是BPD保護性基因[15]。本研究結果顯示SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型頻率和等位基因頻率在BPD和對照組中差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。鑒于本研究樣本量較小,且SP-D基因存在種族或地域差異性，本研究并不能完全確定SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr與BPD發(fā)生無關。因此下一步有必要擴大樣本量進行研究，如有條件還可采用更加嚴格的家系或雙胎研究分析，以進一步明確SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多態(tài)性與BPD的發(fā)生之間是否存在相關。

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PolymorphismsofsurfactantproteinDandassociationbetweenpolymorphismsandbronchopulmonarydysplasiainHanracialWuhannewborns

ZHOU Yu-rong,CHANG Li-wen,LI Wen-bin,LIU Wei,ZENG Ling-kong,ZHANG Jia,SHAN Rui-yan,PAN Rui

(DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:lwchang@tjh.tjmu.edu.cn)

AIM: To analyze the genetic polymorphisms of surfactant protein D (SP-D) and to investigate the association between polymorphisms and bronchopulmonary dysplasia (BPD) in Han racial Wuhan newborns.METHODSGenotyping ofSP-Dpolymorphisms was performed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP) in 218 Han racial Wuhan newborns.The method of gene sequencing was used to validate the results.RESULTSThe frequencies of TT,TC,CC ofSP-DMet11Thr were 10.5％,49.1％ and 40.4％,respectively,and the allele frequencies of T and C were 35.1％ and 64.9％,respectively.The frequencies of GG,GA,AA ofSP-DAla160Thr were 54.6％,39.4％ and 6.0％,respectively,and the allele frequencies of G and A were 74.3％ and 25.7％.SP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr displayed no significant association with BPD as compared with control group.CONCLUSIONThe differences inSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr polymorphisms are significant among several ethnic groups.Polymorphisms ofSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr display no significant association with BPD as compared with control group.

Pulmonary surfactant-associated protein D； Alleles； Genotype； Gene polymorphism; Bronchopulmonary dysplasia

1000-4718(2011)05-0968-04

R363; R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.025

2010-11-23

2011-02-20

國家自然科學基金資助項目(No.30872795)；湖北省自然科學基金資助項目(No.2008CDB139)；新教師基金資助項目(高等學校博士學科點專項科研基金，No.200804871058)

△ 通訊作者 Tel：027-83663345;E-mail：lwchang@tjh.tjmu.edu.cn