海藻酸鹽支架-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合物在急性肝衰竭大鼠體內(nèi)的應(yīng)用

林繼宗， 胡昆鵬， 陳署賢， 湯照峰， 林 楠， 許瑞云

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630)

海藻酸鹽支架-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合物在急性肝衰竭大鼠體內(nèi)的應(yīng)用

林繼宗， 胡昆鵬， 陳署賢， 湯照峰， 林 楠， 許瑞云△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討海藻酸鹽支架-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)復(fù)合物在急性肝衰竭大鼠體內(nèi)應(yīng)用的可能性，為人工肝組織的體內(nèi)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。方法BMSCs用氯甲基苯甲酰氨熒光染料(CM-DiI)標(biāo)記后種植于海藻酸鹽支架形成支架細(xì)胞復(fù)合物。動物分實(shí)驗組和對照組，構(gòu)建70%肝切除大鼠模型，實(shí)驗組大鼠給予支架細(xì)胞復(fù)合物平鋪于肝臟創(chuàng)面上，對照組給予單純支架。4周后取出支架細(xì)胞復(fù)合物行熒光顯微鏡追蹤觀察；切片行白蛋白及糖原染色追蹤支架上細(xì)胞的分化；同時比較兩組大鼠生存率及肝功能變化情況。結(jié)果CM-DiI能很好地標(biāo)記細(xì)胞。體內(nèi)應(yīng)用后BMSCs能夠在海藻酸鹽支架上分泌白蛋白，合成糖原。實(shí)驗組大鼠的生存率及肝功能改善情況優(yōu)于對照組。結(jié)論海藻酸鹽支架-BMSCs復(fù)合物在急性肝衰竭大鼠體內(nèi)能夠起到部分肝功能支持的作用。

海藻酸鹽支架； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 急性肝功能衰竭； 人工肝

目前，對于各種終末期肝臟疾病來說，肝移植是唯一的治療手段，但是由于供肝緊缺和終身的免疫抑制藥物治療大大限制了肝臟移植的應(yīng)用。在這種情況下，為這些患者尋找另一種治療方法來替代肝臟移植便成為了新的焦點(diǎn)。近年來，肝組織工程的發(fā)展為各種終末期肝病的治療帶來了新的思路和希望[1]。肝組織工程即把合適的種子細(xì)胞與生物支架材料相結(jié)合，在一定的微環(huán)境下，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成一定量的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和組織，再移植到患者體內(nèi)以修復(fù)或替代肝臟的功能；其最終目標(biāo)是構(gòu)建一個完整的、有功能的、可移植的肝臟。尋找合適的種子細(xì)胞和生物支架材料是肝組織工程的兩個首要任務(wù)。目前組織工程最有希望的種子細(xì)胞即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)，它來源豐富，取材方便，具有多向分化潛能及低免疫源性等特點(diǎn)，而且目前眾多實(shí)驗研究表明BMSCs在體內(nèi)外均能被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞[2-3]；而海藻酸鹽支架具有良好的親水特性、疏松多孔的立體結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的組織相容性已經(jīng)被作為細(xì)胞載體在組織工程上廣泛應(yīng)用。本研究團(tuán)隊在之前的研究中構(gòu)建了BMSCs和海藻酸鹽三維支架復(fù)合物，并利用此復(fù)合物在體外進(jìn)行人工肝組織的構(gòu)建研究，研究發(fā)現(xiàn)二者有望成為肝組織工程新的種子細(xì)胞和細(xì)胞載體[4]。

目前，以生物反應(yīng)器技術(shù)為基礎(chǔ)的生物人工肝更多的被應(yīng)用于體外支持，但是由于技術(shù)的限制、高額的花費(fèi)和護(hù)理上的特殊要求使得這項技術(shù)難以得到長期應(yīng)用。因此，利用三維、多孔的生物材料和細(xì)胞移植技術(shù)為內(nèi)容的肝臟組織工程在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)肝臟功能支持成為一個新的研究焦點(diǎn)[1]。為探討海藻酸鹽支架-BMSCs復(fù)合物是否適合體內(nèi)應(yīng)用，我們擬通過制作70%肝切除大鼠模型，將此復(fù)合物移植到大鼠體內(nèi)，研究BMSCs的分化及此復(fù)合物對大鼠肝臟功能的支持作用，為生物人工肝的體內(nèi)應(yīng)用提供實(shí)驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

Wistar大鼠購自中山大學(xué)動物實(shí)驗中心；海藻酸鹽購自Sigma；DMEM/F12 培養(yǎng)液購自Gibco；氯甲基苯甲酰氨熒光染料(chloro- methylbenzamido dialkyl-carbocyanine, CM-DiI)和Hoechst 33258購自Invitrogen；羊抗鼠白蛋白(albumin, ALB)抗體購自Sigma。

2方法

2.1BMSCs的分離、培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)[5]介紹的方法分離培養(yǎng)BMSCs。

2.2海藻酸三維支架的制備 用0.1%PBS配制6%的海藻酸水溶液，攪拌均勻，高溫高壓(120 ℃、0．15 MPa)滅菌，4 ℃?zhèn)溆?；種入細(xì)胞前用α-2MEM稀釋，終濃度為3%。吸取3%的海藻酸鈉水溶液700 μL滴入24孔塑料培養(yǎng)板的孔中，在孔內(nèi)形成約1 mm厚度的圓盤，再滴入0.1% CaCl22 mL于圓盤上，靜置40 min。待凝膠形成后棄去CaCl2，改用2 mL α-2MEM浸泡，放入4 ℃冰箱，每24 h更換α-2MEM 1次，72 h后用于細(xì)胞培養(yǎng)。

2.3用CM-DiI標(biāo)記BMSCs并種植于海藻酸鹽支架內(nèi) 將CM-DiI用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配成1 g/L溶液；選生長良好的3～6代BMSCs約5×106用DPBS(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)制成細(xì)胞懸液約500 μL，加入CM-DiI液約5 μL，37 ℃孵育10 min，4 ℃冰箱放置20 min，PBS洗3遍后再重懸為50 μL的細(xì)胞懸液接種于海藻酸鹽支架內(nèi)，剩余少量懸液接種于24孔板內(nèi)觀察標(biāo)記的情況。

2.4熒光纖維鏡下觀察CM-DiI標(biāo)記的BMSCs的生長情況 將種植在24孔板內(nèi)的支架細(xì)胞復(fù)合物放置于熒光顯微鏡下分別用普通光和波長在540～650 nm范圍內(nèi)的光觀察。

2.5實(shí)驗分組 成年SD大鼠20只，雌雄各半，分為實(shí)驗組(A組)和對照組(B組)，每組10只。

2.6部分肝切除大鼠模型的建立及海藻酸鹽支架-BMSCs復(fù)合物的植入 大鼠用5%水合氯醛以6 mL/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后取腹部正中切口逐層開腹，分離剪斷肝周韌帶，采用絲線近肝門處結(jié)扎法依次切除肝左葉、中葉，用絲線切割法切除部分肝右上及右下葉，形成肝臟創(chuàng)面，約切除70%肝臟，創(chuàng)面壓迫止血，建立70%肝切除大鼠模型。將標(biāo)記了CM-DiI的支架細(xì)胞復(fù)合物從24孔板內(nèi)取出，平鋪在實(shí)驗組大鼠右肝創(chuàng)面上后關(guān)腹；對照組大鼠只單純平鋪海藻酸鹽支架后關(guān)腹。術(shù)后大鼠注意保溫，室溫維持在25～28 ℃。

3觀察指標(biāo)

3.1大鼠術(shù)后生存率 術(shù)后每天觀察大鼠的生存情況并記錄大鼠的死亡時間至術(shù)后第4周。

3.2術(shù)后肝功能指標(biāo)的變化 各組大鼠分別于術(shù)前、術(shù)后第1 d、第14 d從尾靜脈采血，在全自動生化分析儀上檢測大鼠天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和白蛋白(albumin，ALB)。

3.3冰凍切片觀察支架細(xì)胞復(fù)合物情況 術(shù)后的第4周處死實(shí)驗組和對照組大鼠并取出支架-細(xì)胞復(fù)合物，在冰凍切片機(jī)內(nèi)制成厚度約4微米的冰凍切片，置于熒光顯微鏡下觀察，Hoechst 33258染核觀察細(xì)胞形態(tài)及分布情況。

3.4免疫組化法檢測復(fù)合物內(nèi)BMSCs的分化 4%多聚甲醛固定冰凍切片30 min后，用含0.01% Triton的PBS溶液漂洗3次，滴加3% H2O2溶液作用30 min，PBS溶液漂洗，滴加羊抗鼠ALB溶液，4 ℃孵化過夜，再用DAB顯色，蘇木素復(fù)染5 min，自來水沖洗，脫水、透明、常規(guī)中性樹膠封片，在普通顯微鏡下觀察。

3.5糖原染色觀察復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞糖原儲存的功能 另取部分切片，AAF液(5%冰醋酸+15%甲醛+85%無水乙醇)固定15 min，PBS洗3次，每次3 min；5 g/L高碘酸氧化10 min，蒸餾水稍洗，雪夫(Schiff)試劑避光染色20 min，5 g/L焦亞硫酸鈉滴洗3 min× 3次，蒸餾水稍洗，蘇木素復(fù)染5 min，流水浸洗，脫水、透明、常規(guī)中性樹膠封片，在普通顯微鏡下觀察。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1熒光顯微鏡下觀察CM-DiI標(biāo)記的BMSCs及支架-細(xì)胞復(fù)合物情況

在波長為540～650 nm范圍內(nèi)可觀察到平面上的BMSCs呈長梭形，細(xì)胞膜全部紅染，熒光分布均勻，細(xì)胞核無紅染，核完整；支架上的BMSCs呈紅色的球形結(jié)構(gòu)，團(tuán)塊性聚集生長，見圖1。

Figure 1. The morphology of BMSCs labeled by CM-DiI (fluorescent microscopy, ×200). A: monolayer cells;B: cells in the alginate scaffold.

2熒光顯微鏡下觀察復(fù)合物冰凍切片

手術(shù)后第4周于A組大鼠腹腔中取出支架與細(xì)胞的復(fù)合物,冰凍切片可以看到強(qiáng)烈的紅色熒光沿著支架纖維分布，Hoechst 33258染核后，可以看到細(xì)胞黏附于支架纖維上沿著纖維生長，所有的細(xì)胞核周圍均有紅色熒光分布，見圖2；而B組切片內(nèi)未見紅色熒光，Hoechst 33258染色后切片上可見少量藍(lán)色熒光。

3免疫組化法檢測復(fù)合物內(nèi)BMSCs的分化

白蛋白免疫組化結(jié)果顯示，A組支架上的部分細(xì)胞周圍可見棕色顆粒，見圖3A；而B組大鼠支架上可見部分炎性細(xì)胞附著，但未見棕色顆粒，見圖3B。

Figure 2. The morphology of alginate scaffolds with BMSCs 4 weeks after transplanted into the rats (fluorescent microscopy, ×200). A: labeled by CM-DiI (red);B: labeled by CM-DiI (red) and Hoechst 33258 (blue).

Figure 3. The synthesis of albumin by the cells in alginate scaffolds (immunohistochemical staining, ×200). A: the liver of an acute hepatic failure rat transplanted with alginate scaffold and BMSCs; B: the liver of an acute hepatic failure rat transplanted with alginate scaffold alone.

4糖原染色檢測復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞儲存糖原的功能

糖原染色結(jié)果顯示，A組支架上的部分細(xì)胞胞漿紅染，見圖4A，已具備儲存糖原功能；而B組大鼠支架上可見部分炎性細(xì)胞附著，但未見胞漿紅染的細(xì)胞，見圖4B。

Figure 4. The synthesis of glycogen by the cells in alginate scaffolds (periodic acid-Schiff staining, ×400).A: the liver of an acute hepatic failure rat transplanted with alginate scaffold and BMSCs; B: the liver of an acute hepatic failure rat transplanted with alginate scaffold alone.

Figure 5. The cumulative survival rate of the two groups of rats. The rate of group A was higher than that of group B (n=10,Plt;0.05). A: the acute hepatic failure rats transplanted with alginate scaffold and BMSCs; B: the acute hepatic failure rats transplanted with alginate scaffold alone.

5大鼠生存率比較

實(shí)驗結(jié)束后A組大鼠共死亡2只，存活率為80%；B組死亡5只，存活率為50%。經(jīng)log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，A組存活率高于B組(Plt;0.05)。

6大鼠肝功能指標(biāo)比較

術(shù)前A和B組大鼠各項肝功能指標(biāo)檢查均無顯著差異(Pgt;0.05), 表明實(shí)驗前兩組大鼠肝功能狀態(tài)基本一致。術(shù)后第1 d，兩組大鼠各項肝功能指標(biāo)檢查也無顯著差異(Pgt;0.05)。術(shù)后第14 d，A組大鼠和B組大鼠ALT之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)的比較

討 論

急性肝衰竭、肝硬化、肝癌等肝臟疾病目前仍是醫(yī)學(xué)工作者面臨的難題，死亡率非常高。隨著20世紀(jì)90年代組織工程學(xué)概念的提出和不斷發(fā)展，肝組織工程成為終末期肝病治療的研究熱點(diǎn)并取得顯著進(jìn)展。研發(fā)可供體內(nèi)應(yīng)用的人工肝臟是肝臟組織工程研究的焦點(diǎn)[6]。

肝組織工程研究的首要任務(wù)就是選擇可靠的細(xì)胞來源,并能提供足夠的細(xì)胞數(shù)量。BMSCs由于本身所具有的可塑性，在體外經(jīng)特定誘導(dǎo)條件下可分化肝細(xì)胞，在肝臟組織的修復(fù)過程中，BMSCs又是肝細(xì)胞的重要肝外來源，可分化成肝干細(xì)胞及肝細(xì)胞，從而參與肝功能的修復(fù)和重構(gòu)，使得BMSCs成為肝臟組織工程最有希望的種子細(xì)胞。至于材料的選擇方面，天然基質(zhì)材料具有良好的細(xì)胞相容性和親和性，被廣泛應(yīng)用于組織工程的細(xì)胞載體[7]。海藻酸是從褐藻中提取的一種酸性多糖, 由古洛糖醛酸與甘露糖醛酸組成的嵌段聚合物, 可與二價金屬離子絡(luò)合形成網(wǎng)狀開放晶格的水凝膠，其酶解產(chǎn)物對人體無毒害作用，而且該水凝膠具有很好的親水性, 營養(yǎng)物質(zhì)易于滲透擴(kuò)散[8]。在我們前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)海藻酸支架有非常適合BMSCs生長的特性，BMSCs在海藻酸支架上能夠很好地黏附和擴(kuò)增，在HGF和其它生長因子的作用下，BMSCs能夠被誘導(dǎo)向肝細(xì)胞方向分化，表現(xiàn)出肝細(xì)胞的特性，研究結(jié)果表明BMSCs有望成為肝組織工程新的種子細(xì)胞和細(xì)胞載體。

目前，利用BMSCs的特性來治療肝功能不全的研究大多都只局限于單純利用細(xì)胞移植技術(shù)，如門靜脈注射、脾臟注射、腹腔內(nèi)或肝內(nèi)注射等[9]，將BMSCs移植到肝功能不全的動物模型體內(nèi)后能改善動物的肝功能。但是，當(dāng)注射較大細(xì)胞量時，單純的細(xì)胞移植也存在如門靜脈血栓形成、肺動脈或肝內(nèi)血管栓塞、脾破裂等諸多不足[9]。本研究則結(jié)合三維多孔支架和細(xì)胞移植技術(shù)為核心技術(shù)，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)肝臟功能支持。與單純的細(xì)胞移植相比，三維支架能夠為大劑量細(xì)胞提供足夠的空間；同時通過對支架成分和形態(tài)的優(yōu)化能夠提高細(xì)胞移植效率。

70%肝切除的大鼠肝臟會分泌大量的肝源性細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等，這些因子在肝細(xì)胞再生過程中起著重要的作用[10]。這些因子在肝內(nèi)的富集同時也為BMSCs向肝細(xì)胞分化提供了優(yōu)越的體內(nèi)環(huán)境。一旦BMSCs來到受損的肝臟內(nèi)，局部微環(huán)境就可以激活使BMSCs表型改變的基因，轉(zhuǎn)化為有功能的肝細(xì)胞，參與肝臟再生，促進(jìn)損傷肝臟修復(fù)[11]。肝功能不全大鼠體內(nèi)的微環(huán)境能夠誘導(dǎo)BMSCs在支架材料上向肝細(xì)胞分化并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)肝臟功能的支持，這是BMSCs源性人工肝組織體內(nèi)應(yīng)用的依據(jù)。我們的實(shí)驗結(jié)果顯示，支架上的BMSCs在肝功能不全大鼠體內(nèi)同樣能夠分泌白蛋白并合成糖原，初步具有肝細(xì)胞的功能；同時實(shí)驗組大鼠的生存率和肝功能改善均優(yōu)于對照組。此部分結(jié)果同樣證明BMSCs在體內(nèi)可以分化為肝細(xì)胞，BMSCs源性的人工組織在體內(nèi)能夠改善肝功能不全大鼠的肝功能。構(gòu)建適合體內(nèi)應(yīng)用的人工肝組織是肝組織工程的研究熱點(diǎn)，我們的研究為BMSCs源性人工肝組織在體內(nèi)的進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

通過對移植到體內(nèi)的支架細(xì)胞復(fù)合物的免疫組化檢測，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)后4周實(shí)驗組海藻酸支架上部分細(xì)胞有白蛋白抗體的表達(dá)，糖原染色也發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞具有合成糖原的能力；而對照組海藻酸支架上雖然有部分細(xì)胞附著，但所有細(xì)胞均無白蛋白表達(dá)和糖原的合成。合成白蛋白和糖原儲存這兩項功能正是肝細(xì)胞所特有的，這說明在這2種大鼠模型內(nèi)，種植在海藻酸支架上的BMSCs可以向肝細(xì)胞方向分化。我們通過對實(shí)驗組和對照組大鼠存活率和術(shù)后肝功能指標(biāo)的比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗組大鼠在存活率上高于對照組(Plt;0.05)。在肝功能指標(biāo)上可以看到，在術(shù)后的第14 d，70%的肝切除實(shí)驗組大鼠血清ALT的恢復(fù)情況也優(yōu)于對照組。這說明，海藻酸支架-BMSCs復(fù)合物移植于肝衰竭大鼠體內(nèi)后，支架上的BMSCs不僅能夠分化為肝細(xì)胞，而且此復(fù)合物在體內(nèi)還能夠改善肝功能不全大鼠的肝功能。但在術(shù)后第14 d，兩組大鼠的血清AST和ALB沒有明顯差異，這可能與幾個因素有關(guān)。第一，我們移植的細(xì)胞數(shù)或者在第14 d已經(jīng)轉(zhuǎn)化為有部分肝細(xì)胞功能的BMSCs不夠，而不能對肝衰竭大鼠的肝臟功能起更大的支持作用。第二，本實(shí)驗中采用的細(xì)胞支架未進(jìn)行預(yù)血管化，我們知道，要盡可能發(fā)揮移植物的作用，促進(jìn)移植物與受體之間的血管聯(lián)系是非常重要的。本實(shí)驗中，海藻酸鹽支架-BMSCs復(fù)合物在肝衰竭大鼠體內(nèi)還未能夠全面改善大鼠的肝臟功能，可能與移植物還未完全與受體形成豐富的血管網(wǎng)，直接影響其功能的發(fā)揮。這些不足同時也給我們下一階段的研究提供思路和方向。

體內(nèi)研究BMSCs的分化，穩(wěn)定持久的標(biāo)記是最基本的要求。本研究以CM-DiI為材料標(biāo)記BMSCs。CM-DiI是親脂性熒光染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)作側(cè)向運(yùn)動，從而標(biāo)記整個細(xì)胞。CM-DiI無細(xì)胞毒性，對標(biāo)記細(xì)胞的存活、生長無影響，在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)消失慢[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)在體外CM-DiI標(biāo)記后的細(xì)胞熒光不容易淬滅，標(biāo)記了CM-DiI的細(xì)胞仍能在海藻酸支架上良好地生長和擴(kuò)增，對細(xì)胞無毒性作用；而在體內(nèi)，4周后我們?nèi)匀荒軌虬l(fā)現(xiàn)支架上有穩(wěn)定的強(qiáng)烈的熒光，熒光沿著支架纖維分布，這說明CM-DiI可以作為細(xì)胞體內(nèi)示蹤的穩(wěn)定的染料。

我們把已標(biāo)記了CM-DiI的大鼠BMSCs種植于海藻酸三維支架上，并將此復(fù)合物移植到70%肝切除的大鼠體內(nèi)，證實(shí)支架上的BMSCs可以向肝細(xì)胞分化。目前，要使這一復(fù)合物在體內(nèi)能更好地起到人工肝的作用還有很多問題要解決，包括如何實(shí)現(xiàn)此復(fù)合物管道化、如何使這些被誘導(dǎo)分化的細(xì)胞更具有肝細(xì)胞的功能等。這將為干細(xì)胞的體內(nèi)追蹤和構(gòu)建可供體內(nèi)移植的肝臟組織工程提供一定的實(shí)驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

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Invivouseofalginatescaffoldwithbonemarrowmesenchymalstemcellsinacutehepaticfailurerats

LIN Ji-zong, HU Kun-peng, CHEN Shu-xian, TANG Zhao-feng, LIN Nan, XU Rui-yun

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:xuruiyun@yahoo.com.cn)

AIM: To evaluate the use of alginate scaffold with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in a rat acute hepatic failure model.METHODSBMSCs were labeled with chloro- methylbenzamido dialkylcarbocyanine (CM-DiI), cultured in alginate scaffold and transplanted into the liver of acute hepatic failure rats with 70% liver resection. Four weeks later, the scaffold-cell complexes were taken out, and their abilities to secret albumin (ALB) and store glycogen were examined. The survival rate and liver functions of the rats were also examined.RESULTSCM-DiI was an effective cell tracer. The BMSCs in alginate scaffold secreted ALB and stored glycogen in acute hepatic failure rats. The survival rate and liver functions of the rats treated with scaffold-cell complexes were better than those of the rats treated with alginate alone.CONCLUSIONAlginate scaffold with BMSCs can be used as artificial hepatic tissues in acute hepatic failure rats.

Alginate scaffold; Bone marrow mesenchymal stem cells; Acute hepatic failure; Artificial liver

1000-4718(2011)12-2382-05

R318

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.027

2011-08-14

2011-10-20

△通訊作者 Tel: 020-85253178; E-mail: xuruiyun@yahoo.com.cn