H3N2豬流感病毒誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷與SOD、NO、MDA和OH·變化的相關(guān)性*

徐明舉， 利 凱， 崔紅玉， 魏 東， 張瑞華， 王存連， 李寸欣， 徐 彤

(河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院,河北 宣化 075131)

H3N2豬流感病毒誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷與SOD、NO、MDA和OH·變化的相關(guān)性*

徐明舉， 利 凱， 崔紅玉， 魏 東， 張瑞華， 王存連， 李寸欣， 徐 彤△

(河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院,河北 宣化 075131)

目的探討超氧化物歧化酶(SOD)活性以及一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和羥自由基(OH·)含量的變化與H3N2豬流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的關(guān)系。方法選用6-8周齡、SPF級BALB/c小鼠80只,隨機分為H3N2病毒感染急性肺損傷組和模擬感染對照組，每組各40只。在感染后的第3、5、7、10和14 d,每組處死小鼠6只，做如下處理：其中2只小鼠取肺組織進行HE染色，觀察肺組織的病理學(xué)變化；剩余4只小鼠處死，收集血液分離血清；然后進行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。測BALF 和血清內(nèi)SOD活性以及NO、MDA和OH·含量。結(jié)果病毒感染小鼠肺臟組織學(xué)變化表現(xiàn)為以嚴重的肺泡間質(zhì)水腫、炎性細胞滲出、出血為特征的彌漫性肺泡損傷；與模擬感染對照組相比，感染組BALF與血清內(nèi)的NO、MDA和OH·的含量均明顯增加，差異顯著；感染組SOD活性與對照組相比顯著下降。BALF內(nèi)SOD、NO、MDA和OH·的變化幅度明顯大于血清的變化。結(jié)論感染小鼠血清和BALF內(nèi)NO、MDA和OH·顯著升高，表明在H3N2豬流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺損傷過程中上述自由基可能發(fā)揮重要作用。

H3N2豬流感病毒； 急性肺損傷； 超氧化物歧化酶； 一氧化氮； 丙二醛； 羥自由基

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種以彌漫性肺細胞損傷為基礎(chǔ)，肺水腫和微肺不張為病理特征，并可迅速影響氣體交換功能為臨床特點的肺部炎癥和通透性增加綜合征，多見于機體遭受嚴重感染、創(chuàng)傷、休克、毒物中毒(包括吸入有毒氣體)等[1-3]。豬流感病毒具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，尤其2009年新型甲型H1N1的流行提示豬流感病毒有可能成為造成人類流感流行的潛在因素，目前已經(jīng)證實人-禽-豬重組的H3N2豬流感病毒的存在。目前已知流感病毒是引起急性肺損傷的重要感染性因素之一。關(guān)于流感病毒引起急性肺損傷的機制，目前研究認為炎性細胞因子大量釋放，最終導(dǎo)致彌漫性肺泡損傷為特征的急性肺損傷，最終引起非心源性肺水腫和低氧血癥，導(dǎo)致呼吸衰竭死亡[4]。但是Salomon 等[5]在研究禽流感H5N1病毒導(dǎo)致小鼠肺損傷機制時，使用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)基因缺失小鼠和抑制炎癥因子的糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮進行治療發(fā)現(xiàn)對于死亡率和肺損傷沒有明顯的影響。其它一些研究證實在流感病毒感染引起的ALI/ARDS過程除了TNF-α和白細胞介素 6 (interleukin-6，IL-6)發(fā)揮作用外，可能存在其它更重要的致病機制[6,7]。

自由基學(xué)說(free radical theory)是20世紀50年代的著名學(xué)者Harman首先提出并得到其他學(xué)者的認可。Imai等[8]研究認為活性氧類自由基在激活Toll樣受體-4信號通路進而誘導(dǎo)炎癥細胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要的作用。在研究H3N2豬流感病毒感染小鼠誘導(dǎo)肺損傷過程中我們發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-6為主的炎癥細胞因子明顯增加，表明炎癥細胞及細胞因子與H3N2豬流感病毒引起小鼠肺損傷具有一定的相關(guān)性，而自由基如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和羥基自由基(hydroxyl radical，OH·)是否與H3N2豬流感病毒感染引起小鼠肺損傷具有相關(guān)性目前尚未見到文獻報道。因此，本研究探討SOD、NO、MDA、OH·與H3N2豬流感病毒誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷關(guān)系，為進一步闡明H3N2豬流感病毒引起哺乳動物肺損傷的機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1H3N2豬流感病毒和實驗動物 SI A/ swine /Hebei/2/2008(H3N2)病毒(本實驗室分離、鑒定)，將該病毒經(jīng)10日齡的SPF雞胚(北京實驗動物中心提供)盲傳3代，收集死亡的雞胚感染性尿囊液，分裝后于-70℃冰箱保存，待用；80只6-8周齡的SPF級小鼠，購買于北京梅里亞通實驗動物中心。

1.2主要試劑 SOD、NO、MDA、OH·檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

2方法

2.1H3N2-SIV感染小鼠急性肺損傷模型的建立 80只6-8周齡SPF級BALB/c系雌性小鼠隨機分成2組，每組40只。實驗組用滅菌生理鹽水5倍稀釋的含有豬流感H3N2亞型病毒的雞胚尿囊液經(jīng)鼻腔途經(jīng)接種小鼠,接種劑量為每只0.1 mL。正常組小鼠采取相同途經(jīng)接種0.1 mL的正常雞胚尿囊液作為對照組。接種后的小鼠隔離飼養(yǎng)于無菌室內(nèi)，采取自由飲水和采食。同時觀察小鼠的臨床癥狀和統(tǒng)計死亡率。

2.2小鼠肺組織病理變化的動態(tài)觀察 在H3N2-SIV感染小鼠發(fā)病過程中，于接種后的3、5、7、10、14 d，每組各處死2只小鼠，取左肺的一部分于10%甲醛液固定，經(jīng)石蠟包埋，做成4 μm的切片，HE染色，觀察病理組織學(xué)變化。

2.3血清中SOD活性及NO、MDA和OH·含量的測定 在接種后的3、5、7、10、14 d，每組各處死4只小鼠，收集血液，分離血清，測定NO、MDA、SOD和OH·含量。NO含量用硝酸還原酶法測定；MDA含量用改良的硫代巴比妥酸法測定；OH·含量采用Fenton反應(yīng)進行測定；SOD活性采用亞硝酸鹽法測定，以上操作均嚴格按照相應(yīng)試劑盒使用說明進行。

2.4小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavaged fluid，BALF)內(nèi)SOD活性及NO、MDA和OH· 含量的測定 在感染后的3、5、7、10、14 d，取實驗組和對照小鼠采用斷頸方法處死。參照Majeski等[9]描述的方法收集BALF:處死小鼠后立即剝離氣管,氣管插管后分2次注入4 ℃的滅菌生理鹽水，進行支氣管肺泡灌洗,每次注入0.5 mL。反復(fù)灌洗3-4次,抽吸后注于1.5 mL EP 管中,每只小鼠的BALF的回收率應(yīng)大于80%。將BALF用白細胞稀釋液作1∶5倍稀釋，然后以1 500 r/ min 離心10 min ,除去細胞沉渣, 將上清液于-70 ℃凍存，待用。按照相應(yīng)試劑盒使用說明測量BALF內(nèi)SOD活性及NO、MDA和OH·含量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1臨床癥狀和病理變化

感染小鼠病理組織學(xué)變化以肺部最為嚴重，感染后的第3 d主要表現(xiàn)為支氣管和細支氣管周圍小血管間質(zhì)明顯水腫、疏松，有少量淋巴細胞炎性滲出，尤以肺邊緣最為明顯，支氣管部分黏膜上皮壞死，腔內(nèi)有嗜中性細胞為主的炎癥細胞和脫落的上皮，見圖1B。在感染后的第7 d肺泡壁水腫、增厚，肺泡腔變小，肺泡腔內(nèi)有大量的粉紅色的炎癥蛋白和水腫液；個別樣本出現(xiàn)肺泡間增寬的間質(zhì)性肺炎癥狀；血管和細支氣管周圍的間質(zhì)明顯疏松水腫，內(nèi)有大量的炎癥細胞和紅細胞，形成細支氣管性肺炎。肺組織出血明顯，在肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)有大量的紅細胞，見圖1C。對照組小鼠肺組織未見異常變化，見圖1A。

2血清SOD活性及NO、MDA和OH·含量的變化

感染的實驗組與模擬感染對照組小鼠相比，血清中NO、MDA和OH·的含量從感染后的第3 d開始逐漸升高，出現(xiàn)顯著差異(Plt;0.05);從感染后的第6-7 d，血清中NO、MDA和OH·的含量極顯著升高，和對照組相比出現(xiàn)極顯著差異(Plt;0.01)；從感染后的第10 d開始，NO、MDA和OH·的含量開始下降，但與對照組相比仍呈顯著差異(Plt;0.05)；SOD活性的變化與NO、MDA和OH·的變化趨勢相反，即感染的實驗組小鼠血清中SOD活性的變化表現(xiàn)下降的趨勢。在感染后第3 d開始至感染后的第10 d，SOD活性出現(xiàn)顯著降低，與對照組相比差異顯著(Plt;0.01)；感染后的第14 d，實驗組小鼠血清中SOD活性開始回升，但仍低于對照組，見圖2。

Figure 1. The histopathological changes of the lung in H3N2 virus-infected mice.A:control group; B, C:infected group 3 days and 7 days after inoculation,respectively.

Figure 2. The activity of SOD and the content of NO,MDA and OH· in serum of mice. ±s.n=4.*Plt;0.05, **Plt;0.01 vs control group.

3支氣管肺泡灌洗液中SOD活性及NO、MDA和羥自由基含量的變化

在支氣管肺泡灌洗液內(nèi)SOD活性及NO、MDA和OH·含量的變化趨勢與血清中的變化完全一致，只是變化的幅度更大，出現(xiàn)變化的時間更早。在感染后的第3 d，實驗組內(nèi)小鼠的NO、MDA和OH·即顯著升高(Plt;0.01)，這種變化一直持續(xù)到感染后的第10 d；SOD活性的變化也是從感染后第3 d開始出現(xiàn)顯著的降低(Plt;0.01)；在感染后的第14 d，SOD活性仍明顯低于對照組(Plt;0.05)，見圖3。

討 論

急性肺損傷時,中性粒細胞在炎癥介質(zhì)和趨化因子作用下,經(jīng)黏附、移出血管、趨化游走至炎癥灶,通過吞噬、脫顆粒和呼吸爆發(fā)等反應(yīng)釋放溶酶體酶及氧自由基等一系列代謝產(chǎn)物,在清除致炎物的同時也損傷肺組織,因此活性氧和氧自由基與肺損傷有密切關(guān)系。隨著病情的進展,氧自由基可進一步使脂質(zhì)過氧化,其終產(chǎn)物MDA水平上升,進一步引起蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、DNA斷裂,破壞肺組織結(jié)構(gòu)[10]。本課題先前的研究表明，在H3N2豬流感病毒誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷過程中肺組織及支氣管肺泡灌洗液中嗜中性白細胞顯著增加，因此為進一步誘導(dǎo)以氧自由基為主的自由基的產(chǎn)生創(chuàng)造條件。

本研究發(fā)現(xiàn)血清和支氣管肺泡灌洗液內(nèi)NO、MDA和OH·含量在感染后第3 d開始均顯著增加，至感染后的5-7 d極顯著增加；而且這些自由基含量的變化程度與肺部病理損傷的嚴重程度呈正相關(guān)；血清和支氣管肺泡灌洗液內(nèi)SOD的變化與MDA的變化趨勢相反，表明在H3N2豬流感病毒感染過程中由于以O(shè)H·為主的氧自由基的大量產(chǎn)生，不斷消耗SOD，結(jié)果使SOD的含量不斷下降，不能及時清除這些自由基，進而導(dǎo)致肺泡組織細胞脂質(zhì)過氧化，引發(fā)肺泡組織的廣泛性損傷。這些結(jié)果表明NO、MDA和OH·等參與H3N2病毒感染誘導(dǎo)小鼠肺損傷過程。李華強等[11]利用綠膿桿菌肺炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)，在綠膿桿菌引起的急性肺損傷過程中NO、MAD以及OH·顯著增高, 這提示在急性肺炎時NO、MAD以及OH·水平升高, 提示這些自由基成為造成肺組織損傷的一種重要因素之一。

Figure 3. The activity of SOD and the content of NO,MDA and OH· of BALF in mice±s.n=4. *Plt;0.05, **Plt;0.01 vs control group.

本研究發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液內(nèi)NO、MDA和OH·的含量的變化早于血清，而且變化的幅度也高于血清，這些結(jié)果提示H3N2病毒感染小鼠過程中肺部感染是病毒損傷的主要器官，因此預(yù)防和控制H3N2豬流感病毒感染導(dǎo)致的肺損傷是將來治療H3N2病毒感染的主要途徑之一。

關(guān)于病毒感染誘導(dǎo)急性肺損傷的機制，目前研究認為炎癥細胞因子尤其是TNF-α和IL-6等大量釋放，引發(fā)炎癥因子風(fēng)暴，導(dǎo)致肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，最終引起肺心源性肺水腫和低氧血癥，引起呼吸衰竭死亡[4]。但是最近的研究利用TNF-α基因缺失小鼠、抗TNF-α的單克隆抗體以及抑制炎癥反應(yīng)的糖皮質(zhì)激素均不能降低H5N1禽流感病毒引起小鼠的死亡率，這些研究提示在病毒性因素引起的肺損傷中以TNF-α和IL-6為主的炎癥因子引起的細胞因子風(fēng)暴不是首要原因。本研究發(fā)現(xiàn)NO、MDA和OH·等在H3N2豬流感病毒的誘導(dǎo)小鼠肺損傷的過程顯著升高，提示因自由基引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷可能是感染動物肺損傷的重要原因，通過阻斷產(chǎn)生NO、MDA和OH·的信號通路進而抑制這些自由基的產(chǎn)生，可能成為將來預(yù)防和治療H3N2豬流感病毒感染導(dǎo)致的肺損傷提供借鑒。

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EffectofH3N2swineinfluenzavirus-inducedacutelunginjuryonchangesofOH·,NO,MDAandSODinmice

XU Ming-ju, LI Kai, CUI Hong-yu, WEI Dong, ZHANG Rui-hua, WANG Cun-lian, LI Cun-xin, XU Tong

(DepartmentofAnimalScience,HebeiNorthUniversity,Xuanhua075131,China.E-mail:xutong1969@sohu.com)

AIM: To investigate the relationship between acute lung injury induced by H3N2 swine influenza virus and the changes of superoxide dismutase(SOD), nitric oxide(NO), malondialdehyde(MDA) and hydroxyl radical(OH·) in mice.METHODSEighty BALB/c mice (6 to 8 weeks old) were divided into H3N2-infected group and mock-infected group. The mice in H3N2-infected group were intranasally inoculated with A/swine/Hebei/2/2008 (H3N2) virus in 100 μL infectious allantoic fluid and the same volume of non-infectious allantoic fluid was given to the mock-infected mice. On the 3rd, 5th, 7th, 10th or 14th day after inoculation, 6 mice in each group were killed and the changes of pathological lesions in the lungs of the mice were observed. The other mice were used to collect bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and serum for determining the content of NO, MDA and OH· and the activity of SOD.RESULTSIn H3N2-infected mice, alveolar and interstitial edema, hemorrhage, inflammation cell migration and infiltration were observed in the lungs, the levels of NO, MDA and OH· in BALF dramatically increased, and the activity of SOD was dramatically decreased in BALF (Plt;0.01) as compared with those in mock-infected mice (Plt;0.01). Although the changes of SOD, NO, MDA and OH· in serum had the same tendency as those in BALF, the extents of the changes were smaller.CONCLUSIONThe increases in NO, MDA and OH· indicate their important roles in acute lung injury induced by H3N2 swine influenza virus in mice.

H3N2 swine influenzavirus; Acute lung injury;Superoxide dismutase; Nitric oxide; Malondialdehyde; Hydroxyl radical

1000-4718(2011)04-0783-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.031

2010-09-25

2011-02-16

河北省教育廳自然科學(xué)基金資助項目(No.2008104)

△通訊作者 Tel:0313-4029336; E-mail:xutong1969@sohu.com