促紅細(xì)胞生成素上調(diào)海馬pCREB表達(dá)和改善腦缺血小鼠認(rèn)知功能*

陳遠(yuǎn)壽， 潘貴書， 秦 偉， 羅孝美， 禹 靜， 張 弛

(1遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室，貴州 遵義 563003；2中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200031)

促紅細(xì)胞生成素上調(diào)海馬pCREB表達(dá)和改善腦缺血小鼠認(rèn)知功能*

陳遠(yuǎn)壽1△， 潘貴書1， 秦 偉1， 羅孝美1， 禹 靜2， 張 弛2

(1遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室，貴州 遵義 563003；2中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200031)

目的探討促紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)小鼠腦缺血所致的認(rèn)知功能障礙和海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法C57BL/6綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、腦缺血/再灌注(I/R)組和EPO治療組；采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷(2-VO)方法復(fù)制小鼠全腦缺血模型，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，Nissl染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元存活情況，Western blotting檢測(cè)磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCREB)表達(dá)水平，激光共聚焦顯微鏡和Neurolucida軟件分析檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及樹突棘的變化。結(jié)果腦缺血導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡和樹突棘丟失；EPO治療能顯著提高腦缺血小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少腦缺血所致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡和樹突棘的丟失，顯著上調(diào)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元pCREB蛋白的表達(dá)。結(jié)論EPO可能通過上調(diào)pCREB的表達(dá)來保護(hù)神經(jīng)元損傷、防止神經(jīng)元樹突棘的丟失，進(jìn)而改善腦缺血小鼠的認(rèn)知功能。

腦缺血； 紅細(xì)胞生成素； cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)； 樹突棘； 學(xué)習(xí)； 記憶

腦缺血可導(dǎo)致患者進(jìn)行性或持久性的認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，目前尚無有效的干預(yù)手段。近年來發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)轉(zhuǎn)錄活性的改變與突觸的可塑性及學(xué)習(xí)記憶功能有密切關(guān)系[1,2]。同時(shí)大量研究顯示，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，可改善嚙齒類動(dòng)物和人的認(rèn)知功能[3,4]。但EPO對(duì)腦缺血后磷酸化CREB (phosphorylated CREB，pCREB)表達(dá)以及樹突棘變化的影響少有報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察EPO治療后腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元損傷、pCREB表達(dá)以及樹突棘的變化，深入探討EPO的神經(jīng)保護(hù)作用和改善腦缺血小鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

雄性C57BL/6 GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，質(zhì)量25-30 g，2-3月齡，由中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物室提供。EPO購自Sigma；兔抗pCREB、GAPDH多克隆抗體購自Santa Cruz。DT-200小鼠跳臺(tái)儀(成都泰盟公司)；顯微鏡(Nikon)；LSM510 META激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss)；CM1850冰凍切片機(jī)(Leica)。

2方法

2.1動(dòng)物分組及給藥 36只小鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)(sham)組、腦缺血/再灌注模型(ischemia/reperfusion,I/R)組、EPO治療(EPO)組。每組12只。EPO治療組小鼠于缺血前30 min和缺血/再灌注后每天腹腔內(nèi)注射1次EPO(3 000 U/kg)，sham組和I/R組在相同時(shí)點(diǎn)注射等容量生理鹽水。

2.2腦缺血/再灌注模型的制作 參照文獻(xiàn)[5]，小鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg，ip)麻醉后，無菌操作下行頸部正中切口，分離、夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，松開小動(dòng)脈夾行再灌注7 d。在手術(shù)造模和再灌注期間均應(yīng)維持小鼠體溫在(37±0.5)℃。Sham組小鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)處理，但不進(jìn)行兩側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉。

2.3行為學(xué)實(shí)驗(yàn)-跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(step-down test) 測(cè)試 參照文獻(xiàn)[6]行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)第1 d先將小鼠放入箱內(nèi)熟悉環(huán)境5 min，然后將小鼠放置于反應(yīng)箱內(nèi)的銅柵上，立即通36 V交流電，記錄小鼠跳上安全臺(tái)的反應(yīng)時(shí)間(reaction time，RT)和5 min內(nèi)從臺(tái)上跳下受到的電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù)，number of errors,NR)，以此作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后進(jìn)行重測(cè)驗(yàn)，將小鼠放在平臺(tái)上，記錄其第1次跳下平臺(tái)的潛伏期(step-down latency，SDL)和5 min內(nèi)受到電擊的錯(cuò)誤次數(shù)，此為記憶成績(jī)。

2.4腦組織灌流及組織切片 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)后，各組動(dòng)物取8只，用10%水合氯醛(300 mg/kg，ip)麻醉，用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛透心灌注固定，迅速取腦，避光下后固定過夜，分別用15%和30%蔗糖脫水直至腦組織沉下。行海馬連續(xù)冠狀冰凍切片(20 μm)。

2.5Nissl染色 海馬切片浸入1∶1乙醇和氯仿溶液中30 min，梯度乙醇(100%, 95%,80%, 70%, 60%, 50%)分化，蒸餾水沖洗后用甲酚紫染液浸染30 min，蒸餾水洗，用梯度乙醇(50%, 60%, 70%, 80%, 95 %, 100%)脫水，二甲苯透明(2×5 min)，DPX封片，顯微鏡明場(chǎng)下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。各組選取切片8張，在顯微鏡下對(duì)海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元計(jì)數(shù)分析。

2.6海馬CA1神經(jīng)元圖像采集及樹突棘的形態(tài)定量分析 取各組海馬切片，應(yīng)用LSM510 META激光掃描共聚焦顯微鏡逐層掃描拍攝轉(zhuǎn)染有GFP的海馬CA1錐體細(xì)胞，掃描拍攝圖像經(jīng)過Neurolucida軟件繪制并重塑神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，用NeuroExplorer軟件統(tǒng)計(jì)出二級(jí)樹突的樹突棘密度。

2.7Western blotting檢測(cè)pCREB的表達(dá) 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)后，各組動(dòng)物取4只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后迅速斷頭取腦，冰上分離出海馬CA1區(qū)組織，立即置-70 ℃冰箱保存。取出標(biāo)本冰上裂解、勻漿，4 ℃離心后取上清，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品蛋白含量。將等量蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉4 ℃過夜，洗滌后加pCREBⅠ抗(1∶1 000)室溫?fù)u晃2 h，洗滌后，加入Ⅱ抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶4 000)室溫?fù)u晃1 h。洗滌后暗室內(nèi)ECL反應(yīng)，曝光、顯影、定影。應(yīng)用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照GAPDH的灰度值做比較，計(jì)算相對(duì)灰度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1EPO提高腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

行為學(xué)結(jié)果顯示，第1次測(cè)試時(shí)，受電擊后I/R組小鼠的反應(yīng)時(shí)間較sham組明顯延長(zhǎng)(Plt;0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)也明顯增多(Plt;0.01)；EPO組小鼠的反應(yīng)時(shí)間較I/R組明顯縮短(Plt;0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)也明顯減少(Plt;0.05)；24 h后第2次測(cè)試發(fā)現(xiàn)，I/R組的SDL與sham組比較明顯縮短(Plt;0.01)，EPO組的SDL較I/R組明顯延長(zhǎng)(Plt;0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)也顯著減少(Plt;0.05)，見表1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2EPO保護(hù)腦缺血所致的海馬神經(jīng)元損傷

Nissl染色和定量分析顯示，與sham組比較，I/R組CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量顯著減少(Plt;0.01)；EPO組CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量明顯多于與I/R組 (Plt;0.01)，但仍低于sham組(Plt;0.01)，見圖1。

Figure 1. Effect of EPO on CA1 neuronal injury after ischemia.A：histological evaluation with Nissl staining (left panels×40，right panels×400); B：quantitative evaluation. ±s. n=8. **Plt;0.01 vs sham group ； ## Plt;0.01 vs I/R group.

3EPO減少腦缺血所致的小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘的丟失

與sham組比較，I/R組CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘明顯脫落、數(shù)量顯著減少(Plt;0.01)；EPO治療后，CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘數(shù)量明顯多于I/R組(Plt;0.01)，見圖2。

Figure 2. Effect of EPO on dendritic spine density in hippocampal CA1 neuron after ischemia.A：histological evaluation under laser scanning confocal microscope (×1 000);B：quantitative evaluation±s. n=8. ** Plt;0.01 vs sham group ； ##Plt;0.01 vs I/R group.

4EPO上調(diào)腦缺血小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元pCREB蛋白的表達(dá)

與sham組比較，I/R組海馬CA1區(qū)pCREB蛋白表達(dá)有所降低，但無顯著差異(Pgt;0.05)；EPO治療后，pCREB蛋白表達(dá)顯著高于sham組與I/R組(Plt;0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of EPO on pCREB protein expression in the hippocampal CA1 region after ischemia.A：Western blotting analysis;B：quantitative evaluation. ±s. n=4. *Plt;0.05 vs sham group；#Plt;0.05 vs I/R group.

討 論

大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明，腦缺血再灌注可導(dǎo)致大腦缺血缺氧易感區(qū)海馬發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致患者或動(dòng)物的認(rèn)知功能障礙[6,7]。本研究也顯示，小鼠腦缺血再灌注7 d后，海馬CA1區(qū)發(fā)生明顯的神經(jīng)元死亡，且伴學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，表明本實(shí)驗(yàn)的腦缺血再灌注模型是成功的。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注7 d后海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘數(shù)量明顯減少，引起了突觸可塑性改變，而突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，在學(xué)習(xí)記憶過程中，突觸可塑性變化常與樹突棘的形成、脫落、擴(kuò)張和萎縮等形態(tài)變化相伴發(fā)生[8]。缺血后樹突棘的丟失可能是小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退的原因之一。

EPO作為一種熱穩(wěn)定糖蛋白激素，具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用[10]，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化，使神經(jīng)元突起增多，突觸功能增強(qiáng)[11-13]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPO對(duì)小鼠腦缺血所致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用，可阻止腦缺血引起的CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘的丟失。樹突棘是神經(jīng)元間形成突觸的主要部位，EPO削弱了腦缺血所致的樹突棘丟失，從而增加了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸的數(shù)量，使腦缺血小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力提高。提示EPO可能會(huì)成為一種防治血管性認(rèn)知功能障礙有希望的藥物。

為進(jìn)一步研究EPO上述作用的可能機(jī)制，我們研究了學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵分子CREB。在早期研究CREB在學(xué)習(xí)記憶中的作用發(fā)現(xiàn)，利用熱沖擊條件誘導(dǎo)一個(gè)CREB的抑制蛋白表達(dá)后，可阻斷果蠅長(zhǎng)時(shí)程記憶的形成。通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明，CREB缺失的突變型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損[14]。而pCREB是CREB的活化形式，調(diào)節(jié)位于其下游的大量基因如即刻早期基因、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等基因的轉(zhuǎn)錄，參與了神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化、存活，以及學(xué)習(xí)記憶等重要作用[1,2,15,16]。本研究結(jié)果中I/R組pCREB表達(dá)并未下調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17,18]。也有報(bào)道在腦缺血早期，pCREB表達(dá)可快速上調(diào)(5 min內(nèi))，然后逐步回落[17]，現(xiàn)在認(rèn)為這可能是機(jī)體對(duì)缺血腦損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)效應(yīng)[17,18]。同時(shí)，我們觀察到EPO治療后，腦缺血小鼠海馬CA1區(qū)pCREB的表達(dá)明顯上調(diào)，小鼠認(rèn)知功能得到明顯改善。這些結(jié)果提示，刺激腦缺血小鼠海馬CREB的轉(zhuǎn)錄活性可能是EPO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及其促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶作用的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，EPO可明顯削弱腦缺血/再灌注所致的小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元損傷和樹突棘的減少，改善腦缺血引起的小鼠認(rèn)知功能缺陷，提高腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與上調(diào)海馬CA1錐體神經(jīng)元pCREB的表達(dá)以及改變海馬突觸可塑性有關(guān)。這為探討EPO的神經(jīng)保護(hù)作用和提高學(xué)習(xí)記憶能力的分子機(jī)制補(bǔ)充了新內(nèi)容，為臨床上防治缺血腦損傷與認(rèn)知功能缺陷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

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Erythropoietinattenuatescerebralischemia-inducedcognitivedysfunctionthroughstimulationofhippocampalCREBphosphorylationinC57BL/6mice

CHEN Yuan-shou1, PAN Gui-shu1, QIN Wei1, LUO Xiao-mei1, YU Jing2, ZHANG Chi2

(1DepartmentofPhysiology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China;2InstituteofNeuroscience,StateKeyLaboratoryofNeuroscience,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,China.E-mail:jcbshengli@163.com)

AIM: To investigate the neuroprotective effect of erythropoietin (EPO) on cognitive dysfunction and neuronal injury in hippocampal CA1 region induced by cerebral ischemia in mice.METHODSMale C57BL/6 green fluorescent protein-transgenic mice were randomly divided into 3 groups: sham operation group (sham), ischemia/reperfusion group (I/R) and EPO-treated group. Transient cerebral global ischemia was induced by bilateral common carotid artery occlusion (2-VO). The step-down test was used to measure the capacity of learning and memory of the animals in each group. Nissl staining was applied to examine the neuronal number in hippocampal CA1 region. The expression of phosphorylated cAMP response element-binding protein (pCREB) was determined by Western blotting. Alterations of dendritic morphology in hippocampal CA1 region were evaluated using laser scanning confocal microscopy and Neurolucida software.RESULTSTransient cerebral ischemia caused deficits of spatial learning and memory, and delayed neuronal death and loss of dendritic spines in hippocampal CA1 region were also obvious. The EPO treatment significantly improved the cognitive function in cerebral ischemic mice, and the protein expression of pCREB was obviously increased. At the same time, neuronal death and loss of dendritic spines were reduced in hippocampal CA1 region.CONCLUSIONErythropoietin increases the protein expression of pCREB, and reduces neuronal death and loss of dendritic spines. These processes may be responsible for erythropoietin-mediated neuroprotective effects and the improvement of cognitive function in cerebral ischemic mice.

Brain ischemia; Erythropoietin; cAMP response element-binding protein; Dendritic spine; Learning; Memory

1000-4718(2011)04-0722-05

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.019

2010-10-10

2011-01-20

中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目(No.SKLN2008A04)

△通訊作者Tel：0852-8609442；E-mail：jcbshengli@163.com