補(bǔ)陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的影響*

張泓波， 高維娟， 錢 濤， 唐敬龍， 李 君

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

補(bǔ)陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的影響*

張泓波， 高維娟△， 錢 濤， 唐敬龍， 李 君

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

目的觀察補(bǔ)陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-cREB反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號(hào)通路的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為補(bǔ)陽還五湯組、尼莫地平組、模型組、假手術(shù)組。用改良Pulsinelli’s四血管阻斷法建立血管性癡呆大鼠模型,分別給予相應(yīng)的藥物，連續(xù)30 d。利用放射免疫分析法檢測海馬組織cAMP含量，Western blotting法檢測PKA催化亞基(PKAc)蛋白表達(dá)，電泳遷移率改變分析法檢測CREB的DNA結(jié)合活性。結(jié)果與假手術(shù)組比較, 模型組大鼠海馬組織cAMP含量、PKAc蛋白表達(dá)和CREB的DNA結(jié)合活性均降低(Plt;0.01)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組cAMP含量、PKAc蛋白表達(dá)和CREB的DNA結(jié)合活性均升高(Plt;0.01)。結(jié)論補(bǔ)陽還五湯可增加血管性癡呆大鼠海馬cAMP含量、PKAc蛋白表達(dá)和CREB的DNA結(jié)合活性，增強(qiáng)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的作用。

補(bǔ)陽還五湯； 癡呆,血管性； cAMP； 蛋白激酶A； cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由腦血管因素所導(dǎo)致的智能障礙綜合征。學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級功能，其中樞主要位于海馬。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 (cAMP response element-binding protein，CREB) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在學(xué)習(xí)記憶中起著重要的作用。在該通路中，細(xì)胞膜上的G蛋白耦聯(lián)受體與胞外神經(jīng)遞質(zhì)等配體結(jié)合后活化，刺激腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclases，AC)增加胞內(nèi)cAMP濃度。在長時(shí)程記憶形成期間，cAMP與PKA的調(diào)節(jié)亞基R結(jié)合，導(dǎo)致催化亞基C(PKAc)釋放并移位至細(xì)胞核，使包括CREB在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)磷酸化。磷酸化后的CREB可增強(qiáng)多種靶基因的表達(dá)，形成新的突觸聯(lián)系，從而使獲得的信息得以長期儲(chǔ)存，即形成長時(shí)程記憶[1,2]。補(bǔ)陽還五湯是益氣活血中藥的經(jīng)典名方，在臨床上可改善血管性癡呆患者的智能損傷，但其作用機(jī)制尚不清楚。為此，本研究觀察了補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠海馬cAMP含量、PKAc蛋白表達(dá)和CREB的DNA結(jié)合活性的影響，從而探討cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路在補(bǔ)陽還五湯治療VD中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物與分組 健康成年SD雄性大鼠，鼠齡(5-6)個(gè)月，體重(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001，SPF級]。隨機(jī)分為假手術(shù)(sham-operation)組、模型(VD model)組、補(bǔ)陽還五湯(Buyanghuanwutang,BYHWT treatment)組和尼莫地平(nimodipine treatment)組，每組6只。

1.2藥物及制備 補(bǔ)陽還五湯購自承德北京同仁堂藥店分店，補(bǔ)陽還五湯原方(黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g)水煎2次，煎液合并濃縮后使藥液濃度為含生藥6 250 g·L-1。尼莫地平為天津華津制藥廠生產(chǎn)(批號(hào)為080317)，20 mg,溶于雙蒸水制成2.5 g·L-1的混懸液。高壓滅菌，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫们盎靹颉?/p>

1.3主要試劑和儀器 環(huán)磷酸腺苷放射免疫分析試劑盒([125I]-cAMP RIA,上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素實(shí)驗(yàn)室)；兔抗PKAc單克隆抗體(Abcam)；羊抗兔IgG (KPL)；兔抗β-actin多克隆抗體( Santa Cruz)；CREB寡聚核苷酸探針(上海英俊生物工程有限公司)；核蛋白抽提試劑盒(Pierce)；EMSA試劑盒(Roche)； GC-911-Y-放射免疫計(jì)數(shù)器(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司)；Quantity one凝膠分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2方法

2.1模型建立 采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷(four-vessel occlusion，4-VO )[3]方法。VD大鼠模型：將大鼠行背側(cè)頸正中切口，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)第1頸椎橫突翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min×3 次，每次間隔1 h。假手術(shù)組：只做皮膚切口和組織分離處理，不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉。

2.2給藥及取材 各組大鼠術(shù)后清醒開始灌胃給藥。補(bǔ)陽還五湯組：給予補(bǔ)陽還五湯50 g·kg-1·d-1；尼莫地平組：給予尼莫地平20 mg·kg-1·d-1；模型組和假手術(shù)組均給予生理鹽水10 mL·kg-1·d-1。連續(xù)給藥30 d。第30 d斷頭處死，在低溫修塊臺(tái)上分離出雙側(cè)海馬組織，置液氮中保存。

2.3放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)檢測海馬組織cAMP含量 取各組海馬組織50 mg，放入盛有4 ℃、2 mL、50 mmol/L的醋酸緩沖液(pH 4.75)的勻漿器中充分勻漿。加入2 mL無水乙醇沖洗勻漿器后與勻漿液合并，混勻，靜置5 min，3 500 r/min離心15 min；將上清液收集在青霉素小瓶內(nèi)。再用75%乙醇2 mL洗沉淀，勻漿分散混勻，3 500 r/min離心15 min。合并上清液，60 ℃烘箱中烘干，4 ℃保存。cAMP含量的測定按試劑盒說明書操作進(jìn)行，用nmol/g濕重表示。

2.4Western blotting 檢測海馬組織PKAc蛋白水平 取海馬組織，提取總蛋白并用BCA法測定蛋白濃度定量。各樣本蛋白上樣量為15 μg，經(jīng) 12% SDS-PAGE積層膠80 V，分離膠120 V(恒壓)電泳，300 mA(恒流)4 ℃轉(zhuǎn)膜2.5 h。用5%TBST-脫脂奶粉封閉2 h，后加入兔抗PKAc單抗(1∶2 500)、兔抗β-action(1∶600)4 ℃過夜。Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗5 min×3次。經(jīng)ECL發(fā)光顯影，曝光后將顯影圖像掃描至電腦進(jìn)行分析。結(jié)果以目標(biāo)條帶的吸光度A值與同一樣本β-action蛋白的A值的比值表示。

2.5電泳遷移率改變分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)測定CREB的DNA結(jié)合活性 取海馬組織按核蛋白提取試劑盒提供的操作規(guī)程提取核蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量后-80 ℃保存。設(shè)計(jì)CREB DNA結(jié)合序列 ：5’-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGAGCTAG-3’。探針標(biāo)記參照DIG Gel Shift Kit操作手冊進(jìn)行。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后調(diào)整探針濃度為15.5 pmol/L。取各樣本核蛋白4 μg與標(biāo)記的寡核苷酸探針2 μL 25 ℃孵育15 min。采用6%非變性聚丙烯酰凝膠4 ℃ 80 V電泳分離DNA-核蛋白結(jié)合體。電泳完畢將DNA-核蛋白結(jié)合體轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜，化學(xué)發(fā)光法檢測特異性條帶。經(jīng)曝光、顯影和定影后將圖像掃描至電腦進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠海馬組織cAMP含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織cAMP含量顯著降低(Plt;0.01)；與模型組比較，尼莫地平組與補(bǔ)陽還五湯組海馬組織cAMP顯著升高(Plt;0.01)，見表1。

表1 各組大鼠海馬cAMP含量的比較

2補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠海馬組織PKAc蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織PKAc蛋白表達(dá)水平顯著降低(Plt;0.01)；與模型組比較，尼莫地平組大鼠海馬組織PKAc蛋白表達(dá)水平與補(bǔ)陽還五湯組大鼠海馬組織PKAc蛋白表達(dá)水平顯著升高(Plt;0.01)，見圖1。

3補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性的影響

經(jīng)EMSA檢測和對特異性寡核苷酸與核蛋白的結(jié)合條帶的密度掃描和分析發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性顯著降低(Plt;0.01)；與模型組比較，尼莫地平組與補(bǔ)陽還五湯組大鼠海馬組織CREB結(jié)合活性顯著升高(Plt;0.01)；尼莫地平組、補(bǔ)陽還五湯組大鼠海馬組織CREB的結(jié)合活性之間無明顯差異(Pgt;0.05)，見圖2。

討 論

cAMP作為第二信使在記憶鞏固后期階段有重要作用[4]。cAMP對學(xué)習(xí)記憶絕大多數(shù)功能作用是通過激活PKA實(shí)現(xiàn)的。PKA是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)蛋白磷酸化的激酶，它的活化可參與突觸功能、神經(jīng)活性物質(zhì)的合成與釋放、受體敏感性及脫敏和基因表達(dá)等的調(diào)控，是記憶形成的必要條件[5]。CREB在記憶活動(dòng)中作為從共價(jià)修飾短期過程到轉(zhuǎn)錄依賴長期過程的樞紐，是長期記憶形成過程所必需的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。它可在多種信號(hào)通路激酶的作用下實(shí)現(xiàn)Ser133磷酸化而活化，其中研究最為透徹的為cAMP-PKA信號(hào)通路[6]。Ser133位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)位于CREB下游的基因(如即刻早期基因immediate-early genes，IEGs)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，從而參與長時(shí)相增強(qiáng)的形成、增加沉默突觸數(shù)量、建立新的突觸聯(lián)系，參與神經(jīng)元的競爭和選擇，利于神經(jīng)元發(fā)育、分化、存活[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組對比，VD大鼠海馬組織中cAMP含量、PKAc蛋白表達(dá)和CREB結(jié)合活性降低，表明cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路弱化參與了VD的發(fā)生和發(fā)展。VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣過高，一則抑制AC的活性，二則激活cAMP特異性磷酸二酯酶 (phosphodiesterase,PDE，能分解cAMP)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，PKA活化減少，進(jìn)而影響CREB調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄，妨礙學(xué)習(xí)和記憶的形成[8]。

Figure 1. The comparision of PKAc protein expression in rat hippocampus of each group±s.n=6.**Plt;0.01 vs sham operation group; ##Plt;0.01 vs VD model group.

Figure 2. The comparision of CREB DNA-bingding activity in rat hippocampus of each group. ±s.n=6. **Plt;0.01 vs sham operation group.##Plt;0.01 vs VD model group.1:VD model group;2:nimodipine treatment group;3:BYHWT treatment group; 4:sham operation group.

從中醫(yī)角度來看，VD的病機(jī)為“氣虛血瘀”。補(bǔ)陽還五湯中重用黃芪補(bǔ)氣，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷氣，并配以歸尾活血祛瘀而不傷血；川芎、赤芍、桃仁、紅花助歸尾活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡(luò)[9]。反復(fù)慢性腦缺血再灌注損傷是VD的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)理與改善血流動(dòng)力學(xué)、抑止自由基產(chǎn)生、滅活自由基、抑制興奮性氨基酸釋放、防止鈣超載、降低NO與NOS活性、減少炎癥細(xì)胞聚集、保護(hù)血腦屏障和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯后，可增加海馬cAMP含量、PKAc蛋白表達(dá)和CREB結(jié)合活性，結(jié)合前期行為學(xué)和形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]，可見補(bǔ)陽還五湯可增強(qiáng)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路作用，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，減輕神經(jīng)元損傷。Takeo等[12]發(fā)現(xiàn)一種記憶增強(qiáng)劑(奈非西坦)可改善持續(xù)性腦缺血大鼠的空間記憶功能，而這種記憶功能的改善正是通過PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高了頂葉皮質(zhì)和海馬的PKA和磷酸化CREB的含量。

目前關(guān)于cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路在血管性癡呆中的其它作用也有相關(guān)報(bào)道。如該通路在大鼠腦缺血再灌注后軸突生長和誘導(dǎo)中起重要作用[13]； 該通路在神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性損傷后提供神經(jīng)保護(hù)信號(hào)：cAMP通過CREB直接或間接激活相關(guān)基因(如IEGs)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而表達(dá)c-Fos、Jun-B、Jun-D、Bcl-2以及某些神經(jīng)營養(yǎng)因子，使部分細(xì)胞在缺血性損傷后得以存活[14]。以上事實(shí)提示增強(qiáng)cAMP-PKA-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為血管性認(rèn)知障礙患者潛在的治療措施。

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EffectofconcentrateddecoctionofChineseherbalcompoundBuyanghuanwutangoncAMP-PKA-CREBsignalingpathwayinhippocampusofratswithvasculardementia

ZHANG Hong-bo, GAO Wei-juan, QIAN Tao, TANG Jing-long, LI Jun

(DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To evaluate the role of concentrated decoction of Chinese herbal compound Buyanghuanwutang (BYHWT) in cyclic adenosine monophosphate(cAMP)-protein kinase A(PKA)-cAMP response element-binding protein(CREB) signaling pathway in hippocampus of rats with vascular dementia (VD).METHODSThe rats were randomly divided into sham operation group (sham-operated rats treated with normal saline), VD model group (VD rats treated with normal saline), BYHWT treatment group (VD rats treated with BYHWT) and nimodipment treating group (VD rats treated with nimodipine). The rat model of VD was build by the method of four-vessel occlusion. The rats in all 4 groups were administered with the corresponding reagents for successive 30 days. The content of cAMP was measured by radioimmunoassay. The expression of PKA catalytic subunit (PKAc) was observed by Western blotting. The changes of DNA-binding activity of CREB in rat hippocampus were detected by electrophoretic mobility shift assay.RESULTSThe content of cAMP, the expression of PKAc and the DNA-bingding activity of CREB in the hippocampus of VD rats were lower than those in the hippocampus of sham-operated rats (Plt;0.01). The above indexes in both nimodipine treatment group and BYHWT treatment group were definitely higher than those in VD model group (Plt;0.01).CONCLUSIONBYHWT increases the content of cAMP, the expression of PKAc and the DNA-binding activity of CREB in VD rat hippocampus, thus strengthening the cAMP-PKA-CREB signaling pathway.

Buyanghuanwutang; Dementia,vascular; cAMP; Protein kinase A; cAMP response element-binding protein

1000-4718(2011)04-0718-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.018

2010-09-23

2011-01-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30772873)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研重點(diǎn)課題(No.20090582)

△通訊作者 Tel：0314-2291141；E-mail：gwj6088@163.com