苧麻脫膠高效菌劑活化技術(shù)研究

馮湘沅 劉正初 段盛文 鄭科 成莉鳳 鄭霞

摘要：ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑在４～８℃冷藏柜中保存540 d，分段取樣進行成活率檢測，開展高效菌劑活化技術(shù)研究。結(jié)果表明，ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，其成活率保持在８０％以上；該菌劑活化技術(shù)具有工藝流程短、技術(shù)難度小等特點，采用常規(guī)培養(yǎng)基對高效菌劑進行蘇醒與擴增（６、８ ｈ）、誘導（５ ｈ）兩個步驟，即可獲得６ ｈ完成苧麻脫膠的活化菌液；確保高效菌劑活化成功的關(guān)鍵在于掌握“休眠態(tài)的高效菌劑在蘇醒與擴增過程的適應期長短與保存期呈正相關(guān)”的技術(shù)原理。其結(jié)果可為降低企業(yè)實施苧麻生物脫膠工藝的技術(shù)風險、長期保持高效菌劑的優(yōu)良性能提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苧麻脫膠；高效菌劑；活化技術(shù)

中圖分類號：Ｓ５６３．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3136-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｒａｍｉｅ Ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ

ＦＥＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｙｕａｎ，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ－ｃｈｕ，ＤＵＡＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＺＨＥＮＧ Ｋｅ，ＣＨＥＮＧ Ｌｉ－ｆｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＸＪＺＵ－１２０ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ４～８ ℃ ｉｎ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ ｗｉｔｈｉｎ 540 d ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ by step dyeing． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｏｖｅｒ ８０％ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ 540 d， ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ ａｗａｋｅｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ６、８ ｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ５ ｈ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｒａｍｉｅ ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ６ ｈ； ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｏｐｅｒａｂｌｅ， ａｎｄ ｓｏ ｏｎ； ｔｈｅ ｋｅｙ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｉｓｋ ａｎｄ ｋｅｅｐｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｍｉｅ ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ； ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

隨著當今世界能源的緊缺以及國家對環(huán)保力度的加強，草本纖維資源的開發(fā)已引起了人們的高度重視。鑒于草本纖維的提取沿用普遍的傳統(tǒng)和化學方法造成對環(huán)境的污染等問題［１－２］，中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所工程酶項目組針對草本纖維原料的特性，對從自然界分離并采用基因工程手段選育的一個高效菌株進行了系列研究［３－５］，研究形成了“苧麻生物脫膠工藝技術(shù)與設備（ＺＬ９５１１２５６４．８）［６］”、“歐文氏桿菌工廠化發(fā)酵快速提取苧麻纖維工藝（ＺＬ ０７ １ ０３０５３４０．５）［７］”以及“一種草本纖維工廠化脫膠或制漿用高效菌劑制備方法（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）［８］”等發(fā)明專利。同時，應用這些專利技術(shù)在湖南沅江市明星麻業(yè)有限公司、湖北精華紡織集團有限公司等單位建成了高效節(jié)能清潔型苧麻生物脫膠示范工程。

本研究在前期研究基礎上，專門生產(chǎn)了一批高效菌劑在適宜溫度下進行了長期保存，擬通過定期取樣進行活化與鑒定，以期獲得高效菌劑活化技術(shù)，為降低企業(yè)實施苧麻生物脫膠工藝的技術(shù)風險、長期保持高效菌劑的優(yōu)良性能提供科學依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１高效菌劑ＣＸＪＺＵ－１２０菌株２００５年，通過紫外線誘變歐文氏桿菌ＣＸＪＺ９５－１９８而獲得變異菌株，２００７年４月以來在高效節(jié)能清潔型苧麻生物脫膠示范工程推廣應用的菌種。制備方法詳見發(fā)明專利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）說明書。高效菌劑采用可滅菌離心管分裝，塑料真空袋外包裝，４～８℃冷藏柜保存１８個月。

１．１．２活化培養(yǎng)基①蘇醒與擴增培養(yǎng)基。主要組分為葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、ＮａＣｌ、保護劑，自來水配制，自然ｐＨ值，滅菌后備用；②誘導培養(yǎng)基。主要組分為豆餅粉、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、誘導劑，自來水配制，自然ｐＨ值，滅菌后備用。

１．２方法

１．２．１高效菌劑活化前檢測保存期分別為１、３、５、７、３０、９０、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０ ｄ，取出高效菌劑用顯微鏡進行觀測，主要檢測菌體草酸銨結(jié)晶紫染色深淺程度，每個樣品取５個視野數(shù)出深色菌體（活菌）、淺色菌體（軀殼或死菌）的數(shù)量，加權(quán)平均可計算出活菌所占比例；比較并記錄菌體形態(tài)是否有變化。同時，采用平板計數(shù)法測定不同保存期樣品的活菌量，與分裝前高效菌劑活菌量進行比較并計算出活菌所占比例。

１．２．２高效菌劑活化①蘇醒與擴增。按照蘇醒與擴增培養(yǎng)基２％的比例添加不同保存期的高效菌劑，３５ ℃，１８０ ｒ/min振蕩１０ ｈ；②誘導。按照誘導培養(yǎng)基２％的比例接種蘇醒與擴增菌液，３５ ℃，１８０ ｒ/min振蕩５ ｈ。

１．２．３高效菌劑活化效果檢測①蘇醒與擴增過程。采用７５５Ｂ型紫外／可見分光光度計檢測ＯＤ６００nm變化情況［９］；②誘導培養(yǎng)液（活化菌液）用于苧麻生物脫膠試驗。浴比為１∶１０，菌液稀釋５０倍，用自來水配制接種菌液，分裝到５００ ｍＬ錐形瓶中（３００～３５０ ｍＬ／瓶），預熱至３５ ℃，將３０～３５ ｇ苧麻置于接種菌液中浸泡１５ ｍｉｎ，倒出接種余液，置于３５ ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵６ ｈ。按照本課題組創(chuàng)立的“麻管實效法”記錄脫膠結(jié)果。

２結(jié)果與分析

２．１高效菌劑保存過程的監(jiān)測結(jié)果

２．１．１保存過程活菌數(shù)量變化情況根據(jù)試驗設計方案，定期取出不同保存期的高效菌劑進行觀測，結(jié)果列于表１。由表１可見，兩種方法檢測不同保存期的高效菌劑成活率變化趨勢基本相同，數(shù)值比較接近。平板計數(shù)數(shù)值偏低，原因可能是極少數(shù)染色深的菌體實際成活能力不強；高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，依然有８０％以上的成活率；成活率下降比較快的時段在５～３０ ｄ，保存90 d以后的成活率下降幅度比較緩慢。

２．１．２保存過程菌體形態(tài)變化情況圖１為高效菌劑保存３０ ｄ稀釋１００倍樣品的隨機視野顯微照片。照片中有９０％以上、染色較深的長桿狀菌體，通過平板計數(shù)，證明它們就是可以活化出來的正常菌體；同時，也有少數(shù)形態(tài)不很規(guī)則而且染色較淺的菌體，可能就是實際成活能力不強的菌體或者死亡的菌體軀殼。

２．２高效菌劑活化效果監(jiān)測結(jié)果

２．２．１高效菌劑蘇醒與擴增過程ＯＤ值檢測結(jié)果如圖２所示。由圖２ 可知，保存期在540 d以內(nèi)的高效菌劑，經(jīng)過８～１０ ｈ蘇醒與擴增，均可形成ＯＤ600nm超過１．５的活化態(tài)菌液；保存期在７ ｄ以內(nèi)的高效菌劑，其適應期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 d以內(nèi)，其適應期在４ ｈ左右，保存期超過90 d，其適應期長達５ ｈ。概括起來說，處于休眠態(tài)的高效菌劑在蘇醒與擴增過程的適應期長短與保存期呈正相關(guān)?？梢哉f，這就是高效菌劑活化工藝的技術(shù)原理。只要掌握了這個原理，就能根據(jù)高效菌劑保存期的長短適當調(diào)節(jié)蘇醒與擴增的時間，就可以獲得理想的高效菌劑活化效果。

２．２．２活化菌液用于苧麻生物脫膠試驗將６、８ ｈ蘇醒與擴增菌液進行誘導培養(yǎng)５ ｈ以后，接種到苧麻上進行濕潤發(fā)酵６ ｈ，觀測脫膠效果見表２。表２結(jié)果表明，保存期在540 d以內(nèi)的高效菌劑，經(jīng)過８ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養(yǎng)５ ｈ以后，接種到苧麻上進行濕潤發(fā)酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠；保存期在３０ ｄ以內(nèi)的高效菌劑，經(jīng)過６ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養(yǎng)５ ｈ以后，接種到苧麻上進行濕潤發(fā)酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠。

３結(jié)論

１）在４～８ ℃下保存540 d的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑還有較高成活率。結(jié)果表明，按照發(fā)明專利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）說明書生產(chǎn)的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑，在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d以后，成活率還有８０％以上，經(jīng)過８ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養(yǎng)５ ｈ，接種到苧麻上進行濕潤發(fā)酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑活化技術(shù)具有工藝流程短、技術(shù)難度小等特點。無論是蘇醒與擴增培養(yǎng)基還是誘導培養(yǎng)基的主要組分都屬于常規(guī)物質(zhì)。不同保存期的高效菌劑只需要經(jīng)過６～８ ｈ蘇醒與擴增和５ ｈ誘導培養(yǎng)這兩個簡單的工藝過程（累計１１～１３ ｈ），均可形成用于苧麻脫膠的活化菌液，接種到苧麻上濕潤發(fā)酵６ ｈ就能完成苧麻脫膠。

３）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑活化的關(guān)鍵在于掌握菌劑活化技術(shù)原理。處于休眠態(tài)的高效菌劑在蘇醒與擴增過程的適應期長短與保存期呈正相關(guān)，這就是高效菌劑活化的技術(shù)原理。結(jié)果顯示，保存期在７ ｄ以內(nèi)的高效菌劑，其適應期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 ｄ以內(nèi)，其適應期在４ ｈ左右，保存期超過90 ｄ，其適應期長達５ ｈ。結(jié)果還顯示，保存90 ｄ以上的高效菌劑經(jīng)過６ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養(yǎng)５ ｈ，接種到苧麻上進行濕潤發(fā)酵６ ｈ，不能完成苧麻脫膠。

４討論

１）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑保質(zhì)期的界定。本試驗僅以高效菌劑成活率、活化菌液用于苧麻脫膠的效果等指標對不同保存期的高效菌劑進行了活化技術(shù)研究，沒有嚴格按照保質(zhì)期的指標要求設計試驗方案，可能是一個缺陷。苧麻是一種原產(chǎn)于中國、盛產(chǎn)于中國的特色農(nóng)產(chǎn)品［１０］，通過脫膠（初加工）獲得的產(chǎn)品僅用作紡織工業(yè)等制造業(yè)的基礎材料，附加值不會很高，在目前的科學技術(shù)和生產(chǎn)力水平下，采用高效菌劑進行苧麻脫膠應該說是合適的選擇，也是最近取得的突破性成果，但是目前國內(nèi)外沒有相關(guān)標準可以借鑒。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑成活率下降速率不一致的原因。根據(jù)生物活體休眠保存理論，高效菌劑成活率下降速率應該與保存時間呈線性關(guān)系。但是，試驗結(jié)果顯示，高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 ｄ，依然有８０％以上的成活率，成活率下降比較快的時段在５～３０ ｄ，保存90 ｄ以后的成活率下降幅度比較緩慢。其原因有待進一步研究。

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［７］ 劉正初，彭源德，馮湘沅，等．歐文氏桿菌工廠化發(fā)酵快速提取苧麻纖維工藝［Ｐ］．中國專利：ＺＬ ０７１０３０５３４０．５，２００８－０８－０６．

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