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    兩種貴州地方雞線粒體DNA控制區(qū)全序列分析

    2011-11-18 06:23:30王文濤陳彬傅筑蔭
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年15期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異控制區(qū)線粒體

    王文濤 陳彬 傅筑蔭

    摘要:采用PCR和直接測(cè)序的方法測(cè)定興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞線粒體DNA控制區(qū)全序列,分析比較兩者mtDNA D-loop序列3個(gè)區(qū)的變異。結(jié)果表明,興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞線粒體DNA控制區(qū)全序列長(zhǎng)分別為1 231和1 230 bp,其中興義矮腳雞mtDNA控制區(qū)的堿基摩爾分?jǐn)?shù)分別為A 26.92%、T 33.41%、G 13.39%、C 26.29%,長(zhǎng)順綠殼蛋雞的分別是A 27.13%、T 33.58%、G 13.20%、C 26.09%。t檢驗(yàn)顯示兩種貴州地方雞種間線粒體DNA控制區(qū)堿基A與C的含量差異顯著,說(shuō)明A與C之間的顛換較多。興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞的遺傳距離是0.038 6,根據(jù)分子鐘計(jì)算,二者大約在193萬(wàn)年前分歧進(jìn)化。

    關(guān)鍵詞:線粒體DNA控制區(qū);興義矮腳雞;長(zhǎng)順綠殼蛋雞;遺傳變異

    中圖分類號(hào):Q343.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2011)15-3114-02

    Analysis on the mtDNA Control Region of Two Kinds of Guizhou Native Chicken

    WANG Wen-taoa,CHEN Bina,FU Zhu-yinb

    (a. Key Laboratory of Animal Genetic, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region, Ministry of Education;

    b. College of Animal Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

    Abstract: PCR and direct sequencing methods were used to analyze the entire mtDNA D-loop in Xingyi Bantam Chicken and Chang shun Blue-shelled Egg Chicken. The D-loop of Xingyi Bantam and Changshun Blue-shelled Egg Chicken was

    1 231 and 1 230 nucleotides long, respectively. The nucleotide molar fraction of Xingyi Bantam was A 26.92%, T 33.41%, G 13.39%, and C 26.29% , while the compsition of Changshun Blue-shelled Egg Chicken was A 27.13%, T 33.58%, G 13.20% and C 26.09%. The t-test results showed that the difference of the nucleotide A and C content in the mtDNA control region of the two chicken breeds was significant. The genetic distance between the two breeds was 0.038 6. Calculated by molecular clock, the two breeds diverged and evolved about 1.93 million years ago.

    Key words: mtDNA D-loop; Xingyi Bantam chicken; Changshun Blue-shelled Egg Chicken; genetic variation

    線粒體DNA控制區(qū)是非編碼基因區(qū),在進(jìn)化過(guò)程中受環(huán)境的選擇壓力小,表現(xiàn)出進(jìn)化速率快和母系遺傳等特點(diǎn),在鳥(niǎo)類的分類研究中常用作種系發(fā)生的分子標(biāo)記[1]。

    在漫長(zhǎng)的家雞養(yǎng)殖歷史中,貴州形成了豐富的地方雞品種資源。興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞是兩種優(yōu)良的貴州地方雞種,近年來(lái)由于生存環(huán)境遭到破壞、引進(jìn)外地品種雜交改良等人為因素以及某些自然因素的影響,二者的開(kāi)發(fā)利用受到限制[2,3]。對(duì)二者的親緣關(guān)系和起源分化的研究不僅可以弄清它們的親緣關(guān)系狀況,為進(jìn)一步選育和雜交配套提供理論基礎(chǔ),還可探討人工選擇對(duì)同一個(gè)地理群體遺傳分化的影響。本研究通過(guò)比較興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞兩類群間的mtDNA序列變異,分析了二者的親緣關(guān)系。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)用的興義矮腳雞、長(zhǎng)順綠殼蛋雞各為15個(gè)樣本。翅靜脈采血0.5~1.0 mL,肝素鈉抗凝,4 ℃保存?zhèn)溆?。采用TIANam?Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。興義矮腳雞、長(zhǎng)順綠殼蛋雞均由貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)提供。

    1.2PCR反應(yīng)及測(cè)序

    PCR擴(kuò)增引物為PHDL(5′-AGGACTACGGCTT

    GAAAAGC-3′)、PHlH(5′-TTATGTGCTTGACCGAG

    GAACCAG-3′)和L400(5′-ATTTATTGATCGTCCA

    CCTCACG-3′)、PHDH(5′-CATCTTGGCATCTTCAG

    TGCC-3′)(引物名稱末尾字母L、H分別代表輕鏈和重鏈)[4]。25 μL PCR反應(yīng)液中含DNA樣品2 μL,上下游引物各0.8 μL,2×Taq PCR MasterMix試劑12.5 μL,dd H2O 8.9 μL。PCR循環(huán)參數(shù)(30循環(huán))為94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,61~63 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,最后72 ℃延伸4 min。用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TIANgel Midi Purification Kit試劑盒回收純化后由北京諾賽基因組研究中心完成測(cè)序。

    1.3序列分析

    利用Vector NTI Suite 8對(duì)原始DNA序列進(jìn)行對(duì)位排列,并經(jīng)人工仔細(xì)核查后,利用DnaSP 4.0[5]提取變異位點(diǎn)。利用MEGA 4.0[6]統(tǒng)計(jì)堿基組成,并計(jì)算基于Kimura雙參數(shù)模型的遺傳距離。以原雞為外群(GenBank登錄號(hào):AB007720),構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

    2結(jié)果

    2.1mtDNA D-loop區(qū)序列變異

    用Vector NTI Suite 8對(duì)原始DNA序列進(jìn)行對(duì)位排列和剪切對(duì)齊后,得到興義矮腳雞、長(zhǎng)順綠殼蛋雞線粒體DNA控制區(qū)序列全長(zhǎng)分別為1 231 bp、1 230 bp。與興義矮腳雞相比,長(zhǎng)順綠殼蛋雞mtDNA D-loop區(qū)全序列在第446位點(diǎn)缺失。兩者之間共發(fā)現(xiàn) 23個(gè)變異位點(diǎn),包括11個(gè)轉(zhuǎn)換和12個(gè)顛換,11個(gè)轉(zhuǎn)換分別是5次T-C間轉(zhuǎn)換,6次A-G間轉(zhuǎn)換;顛換中,A-T間2次,G-T間1次,A-C 間8次,G-C間1次。

    興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞mtDNA D-loop區(qū)Ⅰ區(qū)有13個(gè)變異位點(diǎn),占總變異數(shù)的56.5%,序列變異率為4.11%;Ⅱ區(qū)有 2個(gè)變異位點(diǎn),序列變異率為0.43%;Ⅲ區(qū)有8?jìng)€(gè)變異位點(diǎn),序列變異率為1.79%。

    2.2mtDNA D-loop區(qū)序列堿基組成

    興義矮腳雞、長(zhǎng)順綠殼蛋雞mtDNA控制區(qū)的堿基含量見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),兩種貴州地方雞A、T、G、C 4種堿基的平均摩爾分?jǐn)?shù)分別為27.02%、33.49%、13.29%、26.19%,A+T含量高于G+C,這符合雞mtDNA D-loop區(qū)是A+T富含區(qū)、而T含量最高的特點(diǎn),表現(xiàn)出mtDNA D-loop區(qū)堿基組成的偏倚性。t檢驗(yàn)顯示兩種貴州地方雞種間線粒體DNA控制區(qū)堿基A與C的含量差異顯著(P<0.05),說(shuō)明A與C之間的顛換較多。

    2.3系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

    基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算興義矮腳雞與長(zhǎng)順綠殼蛋雞的遺傳距離為0.038 6,兩種貴州地方雞種與原雞的遺傳距離為0.210 6。

    依據(jù)測(cè)定的序列,以原雞為外群,構(gòu)建興義矮腳雞、長(zhǎng)順綠殼蛋雞的NJ分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖1)。興義矮腳雞、長(zhǎng)順綠殼蛋雞在系統(tǒng)樹(shù)上各聚成一支,并且各支的置信度很高,特別是種間的置信度達(dá)到99%。

    3討論

    鳥(niǎo)類mtDNA D-loop區(qū)的進(jìn)化速率為每百萬(wàn)年2%[7,8],以此計(jì)算興義矮腳雞與長(zhǎng)順綠殼蛋雞的分歧進(jìn)化時(shí)間約為193萬(wàn)年。但堿基轉(zhuǎn)換易飽和,因此可用顛換估算二者間的分歧時(shí)間。由于沒(méi)有貴州地方雞種進(jìn)化時(shí)間參考,我們以石雞和大石雞為參照。兩種雞mtDNA D-loop區(qū)全序列的顛換數(shù)有10個(gè),其分歧時(shí)間約為190萬(wàn)年[9],堿基顛換速率為5.26個(gè)/百萬(wàn)年。興義矮腳雞和長(zhǎng)順綠殼蛋雞間的堿基顛換數(shù)為12個(gè),由此推算二者的分歧時(shí)間大約為220萬(wàn)年前,屬于更新世第二次寒冷期[10]。貴州地處我國(guó)西南地區(qū),可能是更新世第二次寒冷期嚴(yán)重的山脊冰川作用將二者隔離在不同的低地,最終分歧進(jìn)化成不同的地方雞種。

    參考文獻(xiàn):

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    [3] 王文濤,陳彬,傅筑蔭,等.貴州地方雞種資源的現(xiàn)狀、存在問(wèn)題及對(duì)策[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(8):155-157.

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    [8] 劉益平,朱慶,曾凡同,等.原雞線粒體DNA部分序列多態(tài)性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,35(2):134-140.

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