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    纖維素降解菌的篩選及酶活力測定

    2011-11-18 06:23:30高小朋楊晗袁茂林賀曉龍任桂梅
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年15期
    關(guān)鍵詞:纖維素

    高小朋 楊晗 袁茂林 賀曉龍 任桂梅

    摘要:從延安市寶塔區(qū)楊家灣長期堆積牛糞和秸稈的腐殖土中篩選到17株纖維素降解菌,經(jīng)剛果紅培養(yǎng)基、赫奇遜培養(yǎng)基復(fù)篩,得到TC-2、TC-4、TC-5、TC-6、TC-8、TC-11、TC-12、TC-13共8株可分解纖維素的菌株,對其進(jìn)行纖維素酶活力(CMCA)和濾紙酶活力(FPA)的測定。結(jié)果表明,菌株TC-11產(chǎn)生的兩種酶的酶活力均較高,可作為進(jìn)一步研究的試驗菌株。

    關(guān)鍵詞:纖維素;降解菌;纖維素酶活力;濾紙酶活力

    中圖分類號:Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2011)15-3072-02

    Isolation of Cellulose-degrading Strains and Emzyme Activity Determination

    GAO Xiao-peng,YANG Han,YUAN Mao-lin,HE Xiao-long,REN Gui-mei

    (College of Life Science, Yanan University, Yanan 716000, Shaanxi, China)

    Abstract: Seventeen strains which could degrade cellulose were isolated from soil stacked cow dung and straw for a long time, and eight strains (TC-2, TC-4, TC-5, TC-6, TC-8, TC-11, TC-12, TC-13) of them were selected by Congo red medium and HaoQiXun medium. Then the cellulose and filter paperlyase activities of them were measured. The activities of cellulose and filter paperlyase of TC-11 were both more than 1.0 IU indicating that TC-11 was a valuable strain and worth to be studied in future.

    Key words: cellulose; degradation strain; CMCA; FPA

    進(jìn)入21世紀(jì)以來,能源危機(jī)問題日趨嚴(yán)重。而大量的植物秸稈的主要成分——纖維素經(jīng)過處理后可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)燃料、飼料、肥料等,取代目前由化工燃料合成生產(chǎn)的部分有機(jī)產(chǎn)品[1-3]。

    纖維素的微生物降解已經(jīng)取得了一定的成果[4-8],但由于目前篩選得到的大多數(shù)纖維素降解菌產(chǎn)生的纖維素酶活力(CMCA)低下,成為制約該技術(shù)推廣應(yīng)用的重要原因之一。因此,篩選產(chǎn)生高活性纖維素酶的菌株有著重要的意義。本研究從陜北地區(qū)堆積秸稈和牛糞的土壤中篩選出可高效降解纖維素的菌株,對其進(jìn)行酶活力測定,以期為解決秸稈轉(zhuǎn)化醇類及菌肥的制造奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1供試土樣采自延安市寶塔區(qū)楊家灣長期堆積牛糞和秸稈的腐殖土。

    1.1.2藥品羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、溴百里藍(lán)、剛果紅、3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑,均為分析純。

    1.1.3儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-40*50-BS,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、紫外分光光度計(UV-1240,日本島津)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-B50L,江陰濱江醫(yī)療儀器廠)、氣浴式振蕩器(ZJS-1320,科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

    1.1.4培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、CMC培養(yǎng)基[9]、剛果紅培養(yǎng)基[10]、赫奇遜培養(yǎng)基[11]、產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]。

    1.2方法

    1.2.1纖維素降解菌的篩選①富集:將土樣加到PDA液體培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min,培養(yǎng)3 d后取培養(yǎng)液以體積為5%的接種量接入PDA液體培養(yǎng)基中,重復(fù)3次。②初篩:取0.5 mL富集液加入到CMC培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min,培養(yǎng)3 d后劃線分離,將得到的菌株轉(zhuǎn)接在LB斜面上,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。③?fù)篩:將初篩的菌株接種到CMC培養(yǎng)基上,選出長勢較好的菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基上,選擇透明圈大且清晰的菌株,接入經(jīng)處理過的濾紙條[12]的赫奇遜液體培養(yǎng)基中,28 ℃、培養(yǎng)4 d后,根據(jù)濾紙的裂解程度,選出引起濾紙裂解效果較好的菌株作為下一步的試驗菌株。

    1.2.2酶活力的測定①粗酶液的制備。取試驗菌株培養(yǎng)液,以體積為5%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min、培養(yǎng)一定時間后,取適量培養(yǎng)液,4 ℃、5 000 r/min離心10 min,上清即為粗酶液。②酶活力定義及測定方法[12]。酶活力定義:在pH值5.0、50 ℃條件下,1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解CMC-Na生成1.0 μg的葡萄糖,稱為1個纖維素酶酶活力單位(μg/min,IU);相同條件下,1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解濾紙(經(jīng)過去淀粉處理)生成1 μg葡萄糖,稱為1個濾紙酶酶活力(FPA)單位

    (μg/min,IU)。酶活力的測定:用CMC-Na作底物,50 ℃恒溫水浴,粗酶液水解30 min,用DNS法測定還原糖含量[13],利用還原糖的量來計算酶的活力。

    2結(jié)果與分析

    2.1纖維素降解菌的篩選

    經(jīng)過連續(xù)3次的富集、分離純化,共得到17株菌株;經(jīng)剛果紅培養(yǎng)基和赫奇遜培養(yǎng)基復(fù)篩后,選擇在剛果紅培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明圈大且清晰,在赫奇遜液體培養(yǎng)基中濾紙的裂解效果較好的8株產(chǎn)酶試驗菌株,分別為:TC-2、TC-4、TC-5、TC-6、TC-8、TC-11、TC-12、TC-13。

    2.2酶活力測定結(jié)果

    2.2.1 纖維素酶酶活力由圖1可知,在所有試驗菌株中,TC-11的CMC酶活力最大,12 h時酶活力即達(dá)到所有菌株酶活力的最大值(0.99 IU);菌株TC-13到24 h時酶活力達(dá)0.78 IU;而菌株TC-2、TC-5、TC-8的酶活力變化不大,同時這3株菌株的酶活力均低于0.19 IU;其余3株菌株的酶活力隨培養(yǎng)時間的延長而緩慢增加。

    2.2.2濾紙酶活力由圖2可知,除菌株TC-2、TC-5、TC-8外,其余5株菌株的濾紙酶活力均呈現(xiàn)隨培養(yǎng)時間的延長而增加的趨勢,到60 h時TC-11的酶活力最大,為1.05 IU;TC-6、TC-12和TC-13的酶活力也較高,為0.57~0.71 IU。

    綜合以上結(jié)果,菌株TC-11產(chǎn)生的纖維素酶和濾紙酶都有較高的酶活力,因此,選擇該菌株作為下一步制作菌肥、分解纖維素產(chǎn)醇等研究的試驗菌株。

    3討論

    1)在用剛果紅培養(yǎng)基和赫奇遜培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)

    篩時,由于細(xì)胞沒有裂解,胞內(nèi)酶難以釋放至細(xì)胞外,因此可能會把在胞內(nèi)產(chǎn)纖維素酶的菌株淘汰掉,利用離心法得到的粗酶液也基本上為胞外酶。因此,本試驗測定的酶活力主要為胞外酶的活性。

    2)纖維素降解菌大多來自地表覆土,為好氧菌,本試驗采用的是靜置培養(yǎng)分解濾紙,試驗得到的濾紙酶活力較低的菌株可能是由于缺氧,生長不佳所致,改變?nèi)苎蹩赡軙惯@些菌株的濾紙酶活力增強(qiáng)。

    3)本試驗僅是在固定條件下,對試驗菌株產(chǎn)酶的情況進(jìn)行了研究,而酶的產(chǎn)生和酶活力受諸多因素的影響。因此,得到的試驗菌株的產(chǎn)酶條件還有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

    參考文獻(xiàn):

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