紫玉米色素的抗氧化活性研究

肖春玲 張少穎 孫 英

(山西師范大學工程學院,臨汾 041004)

紫玉米色素的抗氧化活性研究

肖春玲 張少穎 孫 英

(山西師范大學工程學院,臨汾 041004)

試驗采用 85∶15的 80%乙醇與 0.2 mol/L的檸檬酸溶液提取紫玉米色素,對其色素的光譜性質(zhì)做了研究;通過建立 DPPH·自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、還原力、雙氧水及 Fe2+螯合能力體系等試驗,測定并對比了紫玉米和抗壞血酸的抗氧化能力。結(jié)果表明:該色素為紫玉米色素,其具有較強的體外抗氧化能力,且清除自由基 (DPPH·和·OH、O2-·)的能力明顯優(yōu)于陽性對照抗壞血酸。其色素粗提物在0.04 mg/mL時,對 DPPH·的清除率達到 89.88%;對·OH的清除率達到 84.87%;在 0.035 mg/mL時,對 O2-·的清除率達到 85.82%。此外,紫玉米色素粗提物的總還原能力、雙氧水清除能力略低于陽性對照抗壞血酸,Fe2+螯合能力約是 EDTA的一半,并且其抗氧化能力的大小與紫玉米色素濃度高低相一致。

紫玉米 色素 抗氧化活性

紫玉米屬禾本科玉米屬,原產(chǎn)于秘魯,后引進我國[1]。紫玉米色素是從紫玉米籽粒中提取的一種花色苷?；ㄉ疹惿厥侵参镏袕V泛存在的一類水溶性天然色素,具有許多的生理作用,如清除自由基、抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化等。目前,對紫玉米色素的研究主要集中在提取劑的選取、浸提技術(shù)及提取工藝上[2-5],對紫玉米色素的抗氧化活性在國內(nèi)外少有報道。隨著人們保健意識的增強和對食品安全性要求的提高,合成色素的使用越來越受到限制,天然色素的發(fā)展日益受到重視。本試驗通過對紫玉米色素的可見光譜來驗證其性質(zhì);并通過 DPPH·自由基體系、羥基自由基體系、超氧陰離子自由基體系、雙氧水體系等方法對紫玉米色素的抗氧化活性進行測定,旨在為拓展紫玉米色素的應用領域提供理論依據(jù),為天然抗氧化劑的開發(fā)提供新的參考資料。

1 材料及儀器

1.1 材料

紫玉米:山西忻州玉米研究所。

1.2 主要儀器

FZ102型微型植物粉碎機:天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;JDG-0.2型真空凍干機:蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司;BS100s型電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;WFJ7200型可見分光光度計:上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試劑

1.1 -二苯代苦味?；杂苫?Sigma公司;甲醇、乙二胺四乙酸、過氧化氫、抗壞血酸、三氯化鐵、鹽酸、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、三 (羥甲基)氨基甲烷、鄰苯三酚、三氯乙酸、硫酸亞鐵、碘化鉀、硫代硫酸鈉、鄰二氮菲 (1,10-菲羅啉),均為分析純。

2 試驗方法

2.1 紫玉米色素的提取、制備及性質(zhì)

選取優(yōu)質(zhì)紫玉米粒,用粉碎機將玉米粒粉碎后,參照徐亞民等[6]方法,以 85∶15的 80%乙醇與 0.2 mol/L的檸檬酸溶液在 60℃下提取 2 h,料液比為1∶8(質(zhì)量與體積比),抽濾,以 100 mL提取液洗滌濾渣,合并 3次濾液,旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā),濃縮,真空凍干得色素粗提物。稱取適量的色素粗提物,用 50%的甲醇定容到 50 mL的容量瓶。制備成 0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04 mg/mL的粗提物溶液備用[7]。取適量色素粗提物,用甲醇稀釋,用可見分光光度計測其在400～650 nm的吸光度[8],并繪制吸收光譜圖。

2.2 紫玉米色素的抗氧化活性的測定

2.2.1 二苯代苦味?；杂苫?(DPPH·)清除能力的測定

準確稱取 2.5 mgDPPH·,用無水甲醇溶解并定容于 100 mL容量瓶中,得到 DPPH·質(zhì)量濃度為25μg/mL的溶液,避光保存 (0～4℃)[9]。

2.2.1.1 不同質(zhì)量濃度色素對DPPH·的清除能力

取不同質(zhì)量濃度色素粗提物溶液 0.1 mL,加入3.9 mL質(zhì)量濃度為 25μg/mL的 DPPH·甲醇溶液,快速混勻后分別于 0、5、10、15、25、35、45、55、65、75 min測定其吸光度 (516 nm),直至吸光度相對穩(wěn)定。繪制色素清除 DPPH·的動力學曲線[10]。

2.2.1.2 不同質(zhì)量濃度色素與抗壞血酸對 DPPH·的清除率

精確吸取不同質(zhì)量濃度的色素粗提物溶液 0.1 mL于試管中,與 3.9 mL 25μg/mL的 DPPH·甲醇溶液混合,搖勻后放置 75 min。用分光光度計測定上述溶液在 516 nm處的吸光度值A1,同時測定 0.1 mL色素粗提物溶液與 3.9 mL甲醇混合均勻后在波長516 nm處的吸光度值 A2,3.9 mL DPPH·甲醇溶液與 0.1 mL蒸餾水混合均勻的吸光值A0。平行測試 3次,計算清除率[11-12]。以抗壞血酸作標準抗氧化劑。DPPH·的清除率 P=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2.2.2 羥基自由基 (·OH)清除能力的測定

吸取色素溶液 2.0 mL于試管中,加入 6 mmol/L的水楊酸溶液 2.0 mL,再加入 6 mmol/L的 FeSO4溶液 2.0 mL,3.5 mL蒸餾水,混勻后加 6 mmol/L H2O22.0 mL,啟動 Fenton反應,搖勻后于 510 nm波長下測定吸光度為 A1;取 2.0 mL的無水甲醇代替濃度為6 mmol/L水楊酸,所測得的吸光度即為 A2;取 2.0 mL的無水甲醇代替色素溶液,所測得的吸光度即為A3;根據(jù)下式計算各待測物對·OH的清除率 P[13]:P=[(1-(A1-A2)/A3)]×100%。

2.2.3 超氧陰離子自由基 (O2-·)清除能力的測定

加入不同質(zhì)量濃度的色素溶液 1 mL,作為待測液,然后加入 50 mmol/L的 Tris-HCl緩沖溶液 (pH為 8.2)9 mL及加入 4.2 mL的蒸餾水,混勻后在25℃的水浴中保溫 20 min,取出后,立即加入在25℃預熱的 0.3 mL的鄰苯三酚溶液,迅速搖勻后,準確反應 3 min,于 420 nm波長下測定吸光度為 A2,同時測定添加鄰苯三酚前樣品的吸光度值為 A1;另外以無水甲醇代替樣品測定鄰苯三酚的自氧化程度為 A0。平行測試 3次,計算清除率[14]。以抗壞血酸作標準抗氧化劑。對超氧陰離子的清除率 P=[1-(A2-A1)/A0]×100%。

2.2.4 還原力的測定

依次加入 2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL1%的鐵氰化鉀溶液和 1 mL不同濃度的色素溶液,混勻,50℃水浴 20 min,快速冷卻后,加入 1 mL 10%的三氯乙酸溶液,加入 2.5 mL蒸餾水和 1.0 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,混合均勻,室溫靜置反應 10 min,在 700 nm處測定吸光度,平行測試 3次,通過吸光值的大小來斷定其還原能力,吸光值越大,表示還原能力越強。以抗壞血酸作標準抗氧化劑[15]。

2.2.5 清除雙氧水能力的測定

分別取不同濃度的色素液和抗壞血酸各 1.0 mL,加入 0.1 mol/L的雙氧水 1.0 mL,37℃保溫 2 h后用標準的 0.01 mol/L硫代硫酸鈉測定剩余雙氧水氧化碘化鉀析出碘的量,同時以淀粉溶液為指示劑。用蒸餾水代替樣品測得的消耗硫代硫酸鈉的平均體積為D1,加入樣品后測得的消耗硫代硫酸鈉的平均體積為D2,不加雙氧水,用蒸餾水代替樣品測得的試劑消耗硫代硫酸鈉的平均體積為D0,平行測試 3次,計算清除率[14]。雙氧水的清除率 P=(D1-D2)/(D1-D0)×100%

2.2.6 Fe2+螯合能力的測定方法

取不同濃度的色素液 1 mL于試管中,分別加入2 mL 0.2%FeSO4溶液,37℃恒溫水浴 30 min,然后加入 0.5 mL 0.3%鄰二氮菲,在 37℃恒溫水浴中反應 10 min。在 510 nm處測定吸光值,設空白對照為A0,色素溶液的吸光值為A1,不加鄰二氮菲時色素溶液的吸光值為 A2,平行測試 3次,根據(jù)下式計算待測物對 Fe2+的螯合率[13]。螯合率 =[1-(A1-A2)/A0]×100%。同時配制同濃度的 EDTA做陽性對照溶液,按照上述步驟計算對 Fe2+的螯合率。

3 結(jié)果與分析

3.1 色素的性質(zhì)

圖 1表示色素的吸收光譜圖。圖 1表明,在可見光區(qū) 525 nm波長處有最大吸收峰,這一吸收峰正屬于紫玉米色素類物質(zhì)的特征吸收 (510～540 nm)。由光譜性質(zhì)檢驗,可以初步推斷該色素為花青素類物質(zhì)。

圖 1 色素在可見區(qū)間的吸收圖譜

3.2 紫玉米色素的抗氧化活性的測定

3.2.1 二苯代苦味?；杂苫?(DPPH·)清除能力的測定結(jié)果

3.2.1.1 不同質(zhì)量濃度的紫玉米色素對 DPPH·的清除能力

圖 2是不同質(zhì)量濃度的紫玉米色素清除 DPPH·的動力學曲線。圖 2表示在 DPPH·體系中加入不同濃度的樣品后,體系的吸光度隨時間的延長不斷下降;并且加樣濃度越大,降幅越大,自由基的清除能力越強。

圖 2 紫玉米色素清除DPPH·的動力學曲線

3.2.1.2 紫玉米色素與抗壞血酸對 DPPH·的清除率

圖 3表示紫玉米色素與抗壞血酸對DPPH·的清除率。圖 3表明,紫玉米色素和抗壞血酸在0.01～0.02 mg/mL范圍時,隨著濃度的增大,二者對 DP PH·的清除率明顯增大,增幅分別為 78.81%和84.34%,當濃度進一步增大時,二者對 DPPH·的清除率雖繼續(xù)增大,但增幅不明顯,僅為 3.9%和17.89%,當質(zhì)量濃度達到 0.035 mg/mL后,清除率基本不再發(fā)生變化。質(zhì)量濃度達到 0.04 mg/mL時,紫玉米色素的清除率達到 89.88%,比抗壞血酸(81.62%)略高,這表明紫玉米紫色素粗提物對 DP2 PH·自由基具有很強的清除能力。紫玉米色素粗提物、抗壞血酸的 EC50值[14]分別為 0.012 5 mg/mL和0.014 mg/mL。從 EC50值來看,DPPH·清除能力為紫玉米色素粗提物大于抗壞血酸。

圖 3 不同濃度的樣品溶液對DPPH自由基的清除效果

3.2.2 羥基自由基 (·OH)清除能力的測定結(jié)果

圖 4表示不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對羥基自由基的清除效果。圖 4表明,紫玉米色素粗提物表現(xiàn)出很強的清除羥自由基活性。在所測濃度范圍內(nèi),清除率均高于陽性對照抗壞血酸,且對羥自由基的清除率隨著濃度的增加而增加。當紫玉米色素和抗壞血酸的質(zhì)量濃度均為 0.01 mg/mL時,二者對·OH的清除率分別為 34.85%和 12.15%,當質(zhì)量濃度增至0.025 mg/mL時,紫玉米色素粗提物的清除率提高到 81.98%,而陽性對照抗壞血酸的清除率為63.16%,增幅分別為 57.49%和 80.76%。當樣品質(zhì)量濃度高于 0.03 mg/mL時,隨著樣品濃度的增加,紫玉米色素粗提物的清除率幾乎不變,而抗壞血酸的清除率仍在不斷增高,在質(zhì)量濃度達到 0.04 mg/mL時,紫玉米色素的清除率達到 84.87%,由此可見,二者對·OH的清除效果與其質(zhì)量濃度之間存在量效關(guān)系,在低于 0.03 mg/mL質(zhì)量濃度下紫玉米色素對·OH的清除效果優(yōu)于抗壞血酸。

圖 4 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對羥基自由基的清除效果

3.2.3 對超氧陰離子 (O2·-)清除能力的測定結(jié)果

圖 5表示不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對超氧陰離子自由基的清除效果。圖 5表明,不同濃度的紫玉米色素粗提物對鄰苯三酚的自氧化有一定的抑制作用,對O2·-有一定的清除效果。紫玉米色素對O2·-清除率與濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,峰值出現(xiàn)在 0.035 mg/mL左右,清除率為 85.82%,而抗壞血酸的清除率隨濃度的增加不斷升高,最高清除率為 82.73%,質(zhì)量濃度達到 0.035 mg/mL時,紫玉米色素的清除率達到 85.82%。因此在紫玉米色素質(zhì)量濃度小于0.04 mg/mL時,O2·-的清除能力為:紫玉米色素粗提物大于抗壞血酸。

圖 5 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對超氧陰離子自由基的清除效果

3.2.4 對三價鐵離子的還原力的測定結(jié)果

圖 6為不同濃度的樣品溶液還原力作用曲線。圖 6表明,在所測定的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增大,紫玉米色素粗提物的吸光值不斷升高,還原能力不斷增強,說明樣品質(zhì)量濃度越大,對三價鐵離子的還原作用越強,但紫玉米色素粗提物的還原能力始終低于同濃度的抗壞血酸溶液,即紫玉米色素粗提物的抗氧化活性低于同濃度的抗壞血酸溶液。

圖 6 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液還原力作用曲線

3.2.5 清除雙氧水能力的測定

圖 7表示紫玉米色素粗提物清除雙氧水的能力?？梢?不同濃度的紫玉米色素粗提物和抗壞血酸溶液對雙氧水均有較強的清除能力。在所測濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)出量效關(guān)系。隨著質(zhì)量濃度的增長,紫玉米色素粗提物對雙氧水的清除能力逐漸增強。當紫玉米色素和抗壞血酸的質(zhì)量濃度均為0.01 mg/mL時,二者對雙氧水的清除率分別為 26.53%和37.73%,繼續(xù)增加樣品濃度,清除率平緩上升。當紫玉米色素和抗壞血酸的質(zhì)量濃度為 0.04 mg/mL時,清除率分別達到了 72.55%和 89.76%。在相同濃度條件下紫玉米色素粗提物對雙氧水的清除率均小于抗壞血酸。

圖 7 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對 H2O2的清除效果

3.2.6 Fe2+螯合能力的測定結(jié)果

圖 8表示紫玉米色素對 Fe2+的螯合能力進行了測定,并以 EDTA為陽性對照。圖 8顯示,紫玉米色素粗提物對 Fe2+具有一定的螯合能力,隨著濃度的升高,螯合 Fe2+能力逐漸增強。但紫玉米色素的螯合能力不及同等質(zhì)量濃度 EDTA的螯合能力,在相同濃度條件下紫玉米色素對 Fe2+的螯合率大約為EDTA的一半。此外,紫玉米色素和 EDTA的 Fe2+螯合率的上升與濃度的增加呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖 8 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對 Fe2+的螯合能力

4 結(jié)論

4.1 紫玉米色素是花青素類物質(zhì)。

4.2 紫玉米色素對 DPPH·自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的抗氧化性,并且其效果均強于抗壞血酸;但其還原力、雙氧水清除能力都略低于抗壞血酸,螯合能力不及同等濃度 EDTA的螯合能力。

4.3 紫玉米色素質(zhì)量濃度在 0.01～0.02 mg/mL范圍時,隨著濃度的增大,對 DPPH·的清除率明顯增大,當質(zhì)量濃度達到 0.035 mg/mL后,清除率基本不再發(fā)生變化;紫玉米色素的 O2-·清除率的上升與濃度的增加呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,清除效果優(yōu)于抗壞血酸。其色素粗提物在 0.04 mg/mL時,對 DPPH·的清除率達到 89.88%;對 ·OH的清除率達到84.87%;在 0.035 mg/mL時 ,對 O2-·的清除率達到85.82 %;

4.4 紫玉米色素粗提物總還原能力、雙氧水清除能力都略低于陽性對照抗壞血酸;對 Fe2+具有一定的螯合能力,隨著濃度的升高,螯合 Fe2+能力逐漸增強,但其螯合能力不及同等濃度 EDTA的螯合能力,在相同濃度條件下紫玉米色素對 Fe2+的螯合率大約為 EDTA的一半。

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Antioxidaion Activities ofAnthocyanidin in Purple Corn

Xiao Chunling Zhang Shaoying Sun Ying
(Engineering College,ShanxiNo rmalUniversity,Linfen 041004)

80%ethanol and citric acid(0.2 mol/L)at ratio of 85∶15 were used to extract the pigment of pur2 ple corn.The antioxidation activities in different systemswere tested and compared with ascorbic acid by building up systemsofDPPH free radicals,hydroxyl free radicals,superoxide anion free radicals,reducing force,hydrogen peroxide and Fe2+chelating ability.Results:The extracted pigment is anthocyanidin.The pigment has a strong external antiox2 idation activity,and its ability of scavengingDPPH·is far better than ascorbic acid.The pigment at concentration of 0.04 mg/ml shows a scavenging rate forDPPH·up to 89.88%,and for·OH 84.87%;the pigment at concentra2 tion of 0.035 mg/ml shows a scavenging rate forO2-·85.82%.In addition,the general reducing force and scaven2 ging rate for hydrogen peroxide solution of the pigment are a little worse than those of ascorbic acid,and its Fe2+che2 lating ability is about half of EDTA.The antioxidation activity of the pigment is consistentwith its concentration.

purple corn,pigment,antioxidation activity

TS202.3

A

1003-0174(2011)02-0018-05

山西師范大學科研課題組(873041),山西師范大學博士科研啟動基金(833089)

2010-01-13

肖春玲,女,1966年出生,教授,碩士,食品科學