一株犬細(xì)小病毒的分離及VP2基因序列分析

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一株犬細(xì)小病毒的分離及VP2基因序列分析

楊龍峰①李英杰①艾萍萍①肖勝南①韓 柳②焦萬(wàn)亮①王建芬①?gòu)堁庸猗賱⒃聼á?（①北京市延慶縣農(nóng)業(yè)局 102100 ②北京誠(chéng)安動(dòng)物醫(yī)院 ③北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所）

采集病犬的糞便，經(jīng)處理后接種狗腎傳代細(xì)胞系(MDCK)，培養(yǎng)96h無(wú)任何細(xì)胞病變，盲傳到第3代時(shí)細(xì)胞系出現(xiàn)明顯的細(xì)胞脫落，核圓縮，形成CPE (cytopathic effect)。繼續(xù)傳代到第7代。第1、2代的細(xì)胞培養(yǎng)物不能凝集豬的紅細(xì)胞，第3代以后的細(xì)胞培養(yǎng)物可以凝集豬的紅細(xì)胞。采用PCR技術(shù)，在各代次的培養(yǎng)物中均能擴(kuò)增得到特異性的DNA片斷，經(jīng)序列測(cè)定后鑒定為犬細(xì)小病毒，定名為BJY06。為進(jìn)一步研究該分離株的遺傳演化情況，擴(kuò)增得到了VP2基因的全序列。經(jīng)序列測(cè)定，用DANStar軟件分析表明BJY06毒株為CPV-2a亞型，所得到的VP2基因全長(zhǎng)1755bp，含有完整的閱讀框架，編碼584個(gè)氨基酸。與其它亞型的毒株相比較核苷酸的同源性為98.3%~99.6%。氨基酸同源性為97.1%~100%。

犬細(xì)小病毒 病毒分離 鑒定 PCR VP2 序列分析

1978年，犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)同時(shí)從加拿大(Thomson等)、澳大利亞(Kelly)患腸炎的病犬中分離獲得[1]。CPV可引起犬的出血性腸胃炎和心肌炎，并使白細(xì)胞大量減少，在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高，癥狀與貓泛白細(xì)胞減少癥相似。本病雖出現(xiàn)的時(shí)間不長(zhǎng)，但目前已擴(kuò)散到世界各地，幾乎所有養(yǎng)犬的地方都有本病的存在[2]。1982年10月，我國(guó)報(bào)道在暴發(fā)傳染性出血性腹瀉的病犬的糞便提取物中發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒，隨后，在我國(guó)各地陸續(xù)有本病發(fā)生的報(bào)道。

本試驗(yàn)從臨床發(fā)病犬的糞便中分離到一株犬細(xì)小病毒，定名為BJY2006。對(duì)其VP2基因進(jìn)行了擴(kuò)增測(cè)序，初步確定為2a亞型。對(duì)該病毒的遺傳特性與演化進(jìn)行了研究，以期為更好地為預(yù)防和控制犬細(xì)小病毒病提供資料。同時(shí)為大范圍的對(duì)CPV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供可行的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

病料采自于北京市某動(dòng)物醫(yī)院的病犬。狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。D-MEM營(yíng)養(yǎng)液、UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒、EZ-10 Spin Column DNA Gel Extration Kit 等購(gòu)買于上海生物工程有限公司。犬細(xì)小病毒快速診斷試紙條購(gòu)買于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。參考GeneBank中的已發(fā)表的CPV的VP2核酸序列，使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，由上海生物工程有限公司合成。

主要儀器 PCR儀(PTC-200)、CO2培養(yǎng)箱(SANYO)、高速冷凍離心機(jī)(SIGMA)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養(yǎng) 將病犬糞便用PBS緩沖液10倍稀釋，再加1/5量的氯仿混和均勻，靜置2min后4000rpm，離心10min，取上清，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾，收取濾液-30℃保存。生長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞消化，傳代，37℃培養(yǎng)6h后，觀察細(xì)胞貼壁完全，再加入1/20量的病料濾液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天2次觀察細(xì)胞病變。96h進(jìn)行傳代培養(yǎng)，共傳7代。每代細(xì)胞培養(yǎng)96h收獲，反復(fù)凍融3次，3000rpm，離心10min，收取上清-30℃保存。

1.2.2 HA試驗(yàn)和金標(biāo)試紙條檢測(cè) 取病料濾液、各代次的細(xì)胞培養(yǎng)物根據(jù)文獻(xiàn)介紹的方法做HA試驗(yàn)[3]。根據(jù)金標(biāo)試紙條使用說明書檢測(cè)并記錄結(jié)果。

1.2.3 病毒DNA的提取 根據(jù)UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為50μL，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照。退火溫度為55℃進(jìn)行PCR反應(yīng)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在顯像儀中觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5 DNA的純化 按照EZ-10 Spin Column DNA Gel Extration Kit 試劑盒的說明書進(jìn)行，純化的DNA送大連寶生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

（1）接種病料的MDCK細(xì)胞在傳到第3代時(shí)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，病變發(fā)生在接種后50h，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、顆粒增多，胞核濃縮，脫落，拉網(wǎng)，病變逐日嚴(yán)重。對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)正常，表明細(xì)胞系中有病毒生長(zhǎng)。

（2）糞便濾液、各代次培養(yǎng)物的HA、試驗(yàn)結(jié)果及PCR擴(kuò)增結(jié)果如表1。

表1 不同方法檢測(cè)CPV的結(jié)果

（3）PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定結(jié)果：使用引物F2，R2擴(kuò)增到了小于500bp的DNA片斷(圖1)，與預(yù)期的大小相符。經(jīng)純化后進(jìn)行序列測(cè)定，堿基數(shù)為426bp，與GeneBank中的已發(fā)表序列比對(duì)同源性為100%。表明分離得到了犬細(xì)小病毒毒株。使用引物F1、R1擴(kuò)增到了2000bp左右大小的DNA片段與預(yù)期大小相符(圖2)。

圖1 CPV特異性PCR結(jié)果

M.DNA Marker DGL2000; 1.BJY06 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(426bp) 2.CPV疫苗株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(426bp)。3.陰性對(duì)照。

圖2 CPV VP2基因PCR結(jié)果

M. DNA Marker DGL2000; 1.BJY06 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1955bp) 2. CPV疫苗株P(guān)CR陽(yáng)對(duì)照(1955bp)。3.陰性對(duì)照。

表2 犬細(xì)小病毒VP2核酸和氨基酸變異位點(diǎn)比較

（4）序列測(cè)定結(jié)果：用引物F1、R2擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度為1955個(gè)核苷酸，包含完整的VP2全基因，由1755個(gè)核苷酸組成，編碼584個(gè)氨基酸。發(fā)生有意義突變的核苷酸及相應(yīng)的氨基酸(表2)進(jìn)行比較分析，BJY06分離株為CPV-2a亞型。

3 討論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，同HA、金標(biāo)試紙條檢測(cè)方法相比較，PCR方法能檢出更少量的CPV，即PCR方法更敏感，特異性更強(qiáng)。HA方法并不能準(zhǔn)確檢出CPV，HA陽(yáng)性只能非特異地表明有病毒生長(zhǎng)，靈敏度也不高，而且觀察結(jié)果也帶有較大主觀性；金標(biāo)試紙條方法特異性比HA方法好，但靈敏度也不高，只有在病毒含量達(dá)到一定濃度時(shí)，有效反應(yīng)才能發(fā)生。相比較認(rèn)為PCR方法可作為MDCK細(xì)胞中病毒繁殖的一種特異、敏感的檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)把PCR檢測(cè)技術(shù)與病毒分離培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，成功的對(duì)犬細(xì)小病毒進(jìn)行了分離。PCR檢測(cè)方法的高敏感性可以檢測(cè)到在MDCK中生長(zhǎng)的微量病毒，能夠在MDCK細(xì)胞未發(fā)生明顯病變前檢測(cè)出CPV的存在，從而提高CPV分離的成功率。同時(shí)隨著寵物疾病診斷條件的提高，PCR診斷方法在臨床工作中的應(yīng)用也將逐漸成為現(xiàn)實(shí)。

2005年邱薇等[4]對(duì)我國(guó)不同地區(qū)分離到的9株細(xì)小病毒毒株進(jìn)行了VP2基因的擴(kuò)增和序列分析，并與CPV的參考毒株進(jìn)行了比較，依據(jù)圖3所示的氨基酸的變化規(guī)律，進(jìn)行了亞型鑒定，9株CPV中有6株屬CPV-2a，3株屬CPV-2b，未檢測(cè)到CPV-2c變異株，表明我國(guó)目前仍以CPV-2a流行為主。本次試驗(yàn)分離到的毒株經(jīng)序列比對(duì)也是CPV-2a亞型。該分型方法與使用單克隆抗體進(jìn)行犬細(xì)小病毒亞型鑒定相比具有經(jīng)濟(jì)、方便的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外的研究者已逐漸認(rèn)可并使用該分型方法。為今后進(jìn)行大范圍的CPV的流行病學(xué)調(diào)查提供了依據(jù)。

BJY06毒株的VP2基因序列進(jìn)行遺傳演化分析(圖3)表明，BJY06與另2個(gè)中國(guó)分離株B-2004和CH-GN同在一個(gè)分支內(nèi)，但親緣關(guān)系最近的是日本株FPV-31、臺(tái)灣株T37和中國(guó)株B-2004。中國(guó)2005年毒株CPV-GN雖然與BJY06仍有較近的進(jìn)化關(guān)系，但為CPV-2b亞型。BJY06與其它亞型的毒株相比較核苷酸的同源性為98.3%~99.6%。與FPV~377的氨基酸同源性最低，為97.1%，與V129、V120、T4、T37、Taiwan 9的同源性最高，為100%。

圖3 .VP2基因遺傳進(jìn)化樹DC, domestic cat; DD, domestic dog; MK, mink; BF, blue fox. JPN, Japan; TWN, Tai wan; CHN, China; VTN, Vietnam; FNL, Finland.

與其它的CPV-2a亞型毒株相比較，在遺傳進(jìn)化關(guān)系上與日本毒株sho-nan在同一個(gè)分支內(nèi)，與V154的距離最遠(yuǎn)。核苷酸同源性在99.3%~99.6%。BJY06與CPV-31的氨基酸同源性最低為99.7%，與V129、V120、T4、T37、Taiwan 9的氨基酸同源性均為100%。表明在該亞型內(nèi)的氨基酸變異很小，幾乎是沒有變化。在297和555位氨基酸美國(guó)株CPV-31為S(絲氨酸)和I(亮氨酸)而BJY06和其它的中國(guó)、日本毒株為A(丙氨酸)和V(纈氨酸)。這兩個(gè)位點(diǎn)的不同究竟有何意義需要進(jìn)一步研究。

[1]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué): 第2版[M].北京：科學(xué)出版社，1997：1145-1173.

[2]董江麗，李淑芬，張鶴齡。犬細(xì)小病毒中國(guó)內(nèi)蒙株VP2基因克隆及序列分析[J]。中國(guó)病毒學(xué)，2000,15(4):379-387.

[3]蔡寶樣, 殷震. 動(dòng)物傳染病診斷學(xué)[M]. 南京: 江蘇科學(xué)技術(shù)出版社, 1993: 418- 422.

[4]邱薇,范泉水,李作生.犬細(xì)小病毒VP2基因的比較及分型研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26 (5):69-72。

[5]Ikeda Y, Mochizuki M, Naito R,Predominance of canine parvovirus in unvaccinated cat population and emergence of new types of CPVs in cats. Virology, 2000:278:13-19.

S852.65+5

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（2010–10–27）