活性炭靜態(tài)吸附馬氏珠母貝胰酶水解產(chǎn)物中氨基酸特性研究

鄭惠娜，章超樺，秦小明，吉宏武，劉書成，曹文紅

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025）

活性炭靜態(tài)吸附馬氏珠母貝胰酶水解產(chǎn)物中氨基酸特性研究

鄭惠娜，章超樺*，秦小明，吉宏武，劉書成，曹文紅

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025）

采用胰酶酶解馬氏珠母貝肉蛋白，研究了活性炭靜態(tài)吸附前后酶解產(chǎn)物中氨基酸及各組分的變化情況。結(jié)果表明：在馬氏珠母貝胰酶水解體系中，結(jié)合態(tài)和游離態(tài)芳香族氨基酸分別被吸附67.4%和42.3%，處于結(jié)合態(tài)的芳香族氨基酸更易于被活性炭吸附，并且活性炭吸附后，分子量較大組分的蛋白或多肽含量明顯下降。

馬氏珠母貝，胰酶，高F值寡肽，活性炭

酶法制備生物活性肽是目前研究的熱點，其中高F值寡肽是一類含有高支鏈氨基酸BCAA（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）和低芳香族氨基酸AAA（酪氨酸和苯丙氨酸）的特殊生物活性寡肽混合物，其不僅具有輔助治療肝性腦病、改善肝昏迷程度和精神狀態(tài)的作用，對于酒精、藥物等所引起的急慢性肝損傷也起到了積極的保肝護(hù)肝作用［1］。在高F值寡肽制備過程中，有效脫除芳香族氨基酸保留支鏈氨基酸既是關(guān)鍵技術(shù)步驟也是難點。理論上，高效液相層析法、離子交換法、吸附色譜法等均具有可行性，但從工業(yè)應(yīng)用角度考慮，吸附法更具有實際可操作性［2］?；诖?，本研究選用珍珠養(yǎng)殖業(yè)的副產(chǎn)品馬氏珠母貝肉為原料制備水解物，探討活性炭對其胰酶水解產(chǎn)物中氨基酸的吸附特性，為馬氏珠母貝高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

馬氏珠母貝 購于湛江市東風(fēng)市場，原料處理：將原料去殼取肉后清水沖洗干凈，然后用保鮮袋分裝，置-20℃冷凍備用；胰酶 北京奧博星生物科技有限公司；AK-310型、AK-220型活性炭 廣州鴻生碳業(yè)化工有限公司；醫(yī)藥級針劑、食品級活性炭 北京太平洋活性炭制品有限公司；767針劑活性炭 上海正?；钚蕴坑邢薰?；磷酸異構(gòu)酶triosephosphate -isomerase（26625Da）、肌 球 蛋 白 myoglobin（16950Da）、抑肽酶 aprotinin（6512Da）、胰島素 B insulin-B（3496Da）、桿菌肽bacitracin（1423Da） 分子量標(biāo)準(zhǔn)品，美國Bio-Rad公司；三肽Gly-His-Leu（423Da） 北京華美生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

數(shù)顯pH-25C酸度計 上?？祪x儀器有限公司；Sigma 3K3高速冷凍離心機 貝朗國際生物工程公司；T18 basic高速組織搗碎機 德國IKA集團(tuán)公司；AUW120電子天平 日本島津儀器公司；恒溫數(shù)顯水浴鍋 余姚東方電工儀器廠；THZ-82恒溫?fù)u床 常州國華電器有限公司；KDN-08C自動凱氏定氮儀、KDN數(shù)顯消化爐 上海新嘉儀器有限公司；HITACHI 835-50氨基酸自動分析儀 日立集團(tuán)有限公司；Waters 600E泵、Waters 2487紫外檢測器 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬氏珠母貝肉蛋白的制備 將馬氏珠母貝肉采用勻漿機勻漿3min（每隔30s停一次），然后按1∶8的比例（w/v）加入蒸餾水，煮沸10min，蒸煮過程中慢慢攪拌以滅活內(nèi)源酶及去除一些雜質(zhì)；然后冷卻至室溫，于10℃下，離心力6000×g離心20min，去除漂浮于上部的脂肪及上清液，收集馬氏珠母貝肉固體蛋白沉淀（HTPM），貯存于-20℃用于進(jìn)一步研究。

1.2.2 AAA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 基于馬氏珠母貝肉蛋白氨基酸組成特點，稱取1.51g酪氨酸與1.49g苯丙氨酸溶于去離子水中，定容到1L，得標(biāo)準(zhǔn)AAA溶液濃度為3.0g/L。

1.2.3 BCAA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取0.84g纈氨酸，0.78g異亮氨酸與1.39g亮氨酸溶于去離子水中，定容到1L，得標(biāo)準(zhǔn)BCAA溶液濃度為3.0g/L。

1.2.4 α-氨態(tài)氮的測定 參考文獻(xiàn)［3］方法。

1.2.5 最佳活性炭的篩選 稱取0.4g干粉活性炭于40mL AAA或BCAA標(biāo)準(zhǔn)溶液中，在25～30℃條件下于恒溫?fù)u床振蕩3h后，過濾得清液，采用α-氨態(tài)氮的測定方法測定溶液中AAA及BCAA的減少總量，計算每克活性炭吸附芳香族氨基酸或支鏈氨基酸的α-氨態(tài)氮的質(zhì)量，結(jié)果計為：（α-AA氨態(tài)氮）g/g（活性炭）。

1.2.6 馬氏珠母貝胰酶酶解產(chǎn)物的制備 稱取馬氏珠母貝肉蛋白HTPM 50g置于三角錐形瓶中，加入pH8.0的磷酸鹽緩沖液，然后于高速組織搗碎機中勻漿2min，在恒溫水浴中預(yù)熱至50℃后加入胰酶啟動酶解反應(yīng)，在錐形瓶口套上保鮮膜，減少酶解過程中水分損失，于恒溫?fù)u床中酶解5h后，95℃水浴滅酶10min，冷卻至室溫，10000r/min離心10min，收集上清液用于下一步研究。

1.2.7 活性炭靜態(tài)吸附馬氏珠母貝胰酶水解產(chǎn)物取一定量的酶解液，按照1∶50的比例加入活性炭，在室溫（25～30℃），pH2.5條件下進(jìn)行吸附，吸附3h，吸附完成后10000r/min高速離心15min，收集上清液測定氨基酸組成及分子量分布。

1.2.8 氨基酸組成分析 稱取樣品數(shù)毫克，加入2mL 5.7mol/L HCl，置于110℃烘箱內(nèi)水解24h，然后除去過量的HCl，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻。采用氨基酸自動分析儀分析，上機條件：流動相為專用緩沖液PI-1、2、3、4（分別為pH2.2、3.3、4.0、6.4檸檬酸鈉緩沖液），流速：0.225mL/min，溫度：25℃，上樣量50μL。

1.2.9 分子量分布分析 吸附前后水解產(chǎn)物的分子量分布采用WatersTM高效體積排阻色譜（HPSEC Waters Corporation，Milford MA，USA）進(jìn)行測定，分析柱為蛋白凝膠柱PROTEIN-PAK 60（WAT085250）。此分析柱是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合一些疏水性基團(tuán)的凝膠柱。分子量測定范圍在1000～20000Da。流動相為pH7.2 0.05mol/L Tris-HCl，流速0.7mL/min，檢測波長214nm，溫度25℃。采用分子量標(biāo)準(zhǔn)品：磷酸異構(gòu)酶 triosephosphate-isomerase（26，625Da），肌球蛋白 myoglobin（16950Da），抑肽酶 aprotinin（6512Da），胰島素 B insulin-B（3496Da），桿菌肽bacitracin（1423Da），三肽Gly-His-Leu（423Da）繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳吸附型號的篩選

為了便于分析及測定，本研究采用芳香族氨基酸和支鏈氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液對五種不同型號的活性炭進(jìn)行篩選。兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液均以馬氏珠母貝肉蛋白中芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的組成特點進(jìn)行配制?；钚蕴烤哂形綆в斜江h(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的特性［4］，因此，其對芳香族氨基酸具有一定的吸附作用，已有許多研究報道采用活性炭吸附酶解產(chǎn)物中的芳香族氨基酸［5-10］。表1分別列出了五種活性炭對芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的吸附效果。

表1 活性炭對AAA及BCAA靜態(tài)吸附能力的比較（n=3）

從表中結(jié)果可看出，活性炭對芳香族氨基酸的吸附作用明顯大于對支鏈氨基酸的吸附作用。五種活性炭中，B、C、D 3種活性炭對芳香族氨基酸吸附效果較接近，但活性炭D對支鏈氨基酸的保留效果相對較好，芳香族氨基酸氨基氮被吸附量與支鏈氨基酸氨基氮被吸附量比值越高，說明活性炭對芳香族氨基酸的吸附效果或?qū)χф湴被岬谋Ａ粜Ч胶?，因此，活性炭D能夠較好吸附脫除芳香族氨基酸保留支鏈氨基酸，選擇食品級活性炭進(jìn)行下一步吸附實驗。

2.2 活性炭吸附前后氨基酸組成變化

馬氏珠母貝胰酶水解產(chǎn)物活性炭吸附前后的氨基酸組成見表2。由表2可知，每100mL酶解液活性炭吸附前后氨基酸總量分別為1812.65、1320.34mg，損失量為492.31mg，損失了27.16%。并從活性炭對酶解液中的芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的吸附效果來看，酪氨酸、苯丙氨酸含量分別減少49.32%和52.89%，同時，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸含量分別減少25.00%、32.60%和19.91%。

為了進(jìn)一步分析活性炭對芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的吸附效果，本研究分別分析了活性炭對處于結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的吸附情況，結(jié)果見圖1。

表2 活性炭吸附前后胰酶水解產(chǎn)物氨基酸組成（mg/100mL）

圖1 活性炭對胰酶水解產(chǎn)物中不同狀態(tài)氨基酸（AAA和BCAA）吸附量的比較

從圖1可以看出，無論是處于結(jié)合狀態(tài)還是游離狀態(tài)，活性炭對芳香族氨基酸的吸附量均高于支鏈氨基酸。酶解產(chǎn)物中約51.2%的芳香族氨基酸和24.69%的支鏈氨基酸被活性炭吸附。并且，結(jié)合狀態(tài)（蛋白質(zhì)或多肽形式）的AAA（67.4%）比游離狀態(tài)的AAA（42.3%）更易于被活性炭吸附。與此同時，31.1%結(jié)合狀態(tài)的BCAA和13.2%游離狀態(tài)的BCAA被活性炭吸附。之前有研究報道指出游離態(tài)BCAA易于被活性炭吸附［8］，這可能是由于不同的原料及酶水解系統(tǒng)所造成的差異性。在本研究的酶水解系統(tǒng)中，活性炭對處于結(jié)合狀態(tài)的AAA的吸附效果要好于游離狀態(tài)，所以，根據(jù)這一特性有望結(jié)合其他方法以達(dá)到制備馬氏珠母貝高F值寡肽的目的。AAA結(jié)構(gòu)相對特殊，含芳香環(huán)，且均為疏水性氨基酸，而活性炭表面具有特殊的亂層石墨結(jié)構(gòu)微晶區(qū)，碳原子呈六角形排列，這種非極性結(jié)構(gòu)使其對有機物碳?xì)洳糠钟袕娏业姆兜氯A力作用，并能使大多數(shù)含芳環(huán)化合物的芳環(huán)部分以平躺方式吸附［11］。因此，活性炭對氨基酸的吸附既受氨基酸自身性質(zhì)影響也受氨基酸存在體系影響，即不同原料蛋白及酶解系統(tǒng)下，活性炭吸附性質(zhì)既與氨基酸本身性質(zhì)有關(guān)，也同該氨基酸與其他氨基酸存在的狀態(tài)有關(guān)。

2.3 活性炭吸附前后組分變化

將分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間（tr）和分子量的對數(shù)LogMw在平面坐標(biāo)系中描點，得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。分子量回歸方程為 LogMw= 6.4972-0.2261tr，決定系數(shù)為0.9837，說明兩者線性相關(guān)性及回歸性良好。

圖2 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到活性炭吸附前后酶解液各組分的變化情況，結(jié)果見圖3、圖4。由圖中結(jié)果可看出，酶解液經(jīng)活性炭吸附后，分子量大于20000、10000～20000Da的組分明顯減少，小于1000Da的組分略有降低，而分子量在5000～10000Da和1000～5000Da的組分則明顯升高?？梢娀钚蕴繉︸R氏珠母貝胰酶水解產(chǎn)物中分子量較大組分的吸附能力要強于對分子量較小組分的吸附能力，這與前面有關(guān)活性炭對結(jié)合態(tài)的AAA或BCAA的吸附性比對游離態(tài)強的分析相符。

圖3 活性炭吸附前后HPSEC圖譜

圖4 活性炭吸附前后各分子量組成比較

3 結(jié)論

在馬氏珠母貝胰酶水解體系中，活性炭對處于結(jié)合狀態(tài)的AAA的吸附效果好于游離狀態(tài)的AAA，并且活性炭吸附后，分子量較大組分的蛋白或多肽明顯被吸附，能夠得到含量較高的小分子肽組分。因此，可利用活性炭對馬氏珠母貝胰酶水解產(chǎn)物的吸附特性并結(jié)合其他有效去除游離態(tài)芳香族氨基酸的方法，有望實現(xiàn)馬氏珠母貝高F值寡肽的制備，達(dá)到馬氏珠母貝高值化利用的目的。

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Characteristics of activated carbon for absorbing amino acids in static state from Pinctada martensii meat protein hydrolysates

ZHENG Hui-na，ZHANG Chao-hua*，QIN Xiao-ming，JI Hong-wu，LIU Shu-cheng，CAO Wen-hong
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

Pinctada martensii meat protein was hydrolysed using pancreatin，then the absorption capacity of activated carbon for amino acids in static state from Pinctada martensii meat protein hydrolysates were investigated.The results showed that in enzymatic hydrolysis system，the aromatic amino acids（67.4%）were adsorbed by activated carbon much easier in the form of proteins and peptides compared with the free state（42.3%）and the content of component with higher molecular weight，protein and polypeptides，decreased significantly.

Pinctada martensii；pancreatin；high fischer ratio oligopeptides；activated carbon

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0098-04

2009-12-25 *通訊聯(lián)系人

鄭惠娜（1979-），女，博士，講師，主要從事水產(chǎn)品開發(fā)與利用研究。

國家科技支撐計劃課題（2007BAD29B09）；農(nóng)業(yè)部948項目（2006-G42）；廣東海洋大學(xué)引進(jìn)人才基金（0912259）。