嗜蟲(chóng)書(shū)虱β-ACTIN基因克隆及定量PCR方法的建立

唐培安 王進(jìn)軍 宋 偉

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210003)

(西南大學(xué)重慶市昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，重慶 400716)

嗜蟲(chóng)書(shū)虱β-ACTIN基因克隆及定量PCR方法的建立

唐培安1王進(jìn)軍2宋 偉1

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210003)

(西南大學(xué)重慶市昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，重慶 400716)

旨在建立嗜蟲(chóng)書(shū)虱的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析方法，為嗜蟲(chóng)書(shū)虱基因的定量分析提供技術(shù)支持。利用RT－PCR方法，從嗜蟲(chóng)書(shū)虱體內(nèi)克隆獲得了β－actin基因cDNA片段(GenBank登錄號(hào):FJ041117)，該基因片段長(zhǎng)度為822 bp，編碼273個(gè)氨基酸殘基(從第3個(gè)堿基開(kāi)始編碼)。根據(jù)此β－actin基因的序列設(shè)計(jì)引物，建立了基于SYBR Green I染料技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。建立的嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增效率高、檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)周期短，為β－actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行嗜蟲(chóng)書(shū)虱功能基因的定量分析奠定了基礎(chǔ)。

嗜蟲(chóng)書(shū)虱 β－actin基因 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 內(nèi)參基因

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real－time PCR)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種準(zhǔn)確、快速的核酸定量分析技術(shù)，是研究基因表達(dá)水平最為有用的方法之一［1－2］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分絕對(duì)定量和相對(duì)定量，在相對(duì)定量檢測(cè)中，需要一個(gè)內(nèi)部參照基因，即“內(nèi)參基因”或稱“看家基因”，對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行校正，以期獲得真實(shí)可靠的結(jié)果［3］。內(nèi)參基因有很多種，常用的有 β －actin、28S rRNA、18S rRNA、GAPDH 和 α －tubulin 等［4－5］。其中，β －actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分——肌動(dòng)蛋白的一種，以往的研究結(jié)果表明，β－actin具有基因序列高度保守、mRNA表達(dá)量高且穩(wěn)定的特點(diǎn)，常作為內(nèi)參基因被廣泛應(yīng)用［6－7］。

儲(chǔ)糧害蟲(chóng)可造成糧食數(shù)量和質(zhì)量的巨大損失，是威脅我國(guó)糧食安全的重要因素［8］。嗜蟲(chóng)書(shū)虱(Liposcelis entomophila Enderlein)隸屬于嚙目(Psocoptera)、書(shū)虱科(Liposcelididae)，是一種世界性儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，我國(guó)大部分地區(qū)都有嗜蟲(chóng)書(shū)虱的分布，通常跟嗜卷書(shū)虱、無(wú)色書(shū)虱和小眼書(shū)虱等混合發(fā)生［9－10］。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，我國(guó)儲(chǔ)糧中書(shū)虱類害蟲(chóng)發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，在糧庫(kù)中經(jīng)常暴發(fā)成災(zāi)，對(duì)糧食安全造成很大的威脅［11－12］。近年來(lái)，隨著科技水平的不斷進(jìn)步，對(duì)書(shū)虱等儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的研究已進(jìn)入分子生物學(xué)領(lǐng)域［13］。然而，通過(guò)搜索 GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)，未發(fā)現(xiàn)可用作嗜蟲(chóng)書(shū)虱基因定量分析的內(nèi)參基因，也未見(jiàn)關(guān)于嗜蟲(chóng)書(shū)虱實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的報(bào)道。因此，本研究首先利用RT－PCR方法克隆獲得了嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因cDNA片段，并以此為內(nèi)參基因建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)嗜蟲(chóng)書(shū)虱相關(guān)功能基因表達(dá)分析研究提供有用的方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試書(shū)虱

嗜蟲(chóng)書(shū)虱1992年采自重慶市北碚區(qū)糧庫(kù)，在實(shí)驗(yàn)室(27±1)℃、75% ±5%RH、不予光照、不接受任何藥劑的條件下以全麥粉、酵母粉和脫脂奶粉(10∶1∶1)混合而成的飼料飼養(yǎng)。

1．1．2 主要儀器和試劑

Mx3000PTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Brilliant SYBR Green QPCR Master mix:美國(guó)Agilent Stratagene公司;Mastercycler?PCR儀:德國(guó)Eppendorf公司;TRIzol試劑:美國(guó)invitrogen公司;PrimeScriptTMRT－PCR Kit、Taq DNA聚合酶、pMD18－T vector:TaKaRa公司;Gel Extraction Mini Kit:上海華舜生物工程有限公司。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已報(bào)道的其它物種的β－actin氨基酸序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多重比對(duì)，找出保守序列，并據(jù)此保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物:

上游引物:5'-GNCARAARGAYWSNTAYGTNGG-3'下游引物:5'-GNGCNARNGCNGTDATYTCYTT-3'根據(jù)試驗(yàn)中克隆獲得的嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因片段，使用Primer 3．0在線引物設(shè)計(jì)軟件(http://frodo．wi．mit．edu/primer3/)設(shè)計(jì) real－ time PCR 引物，其序列如下:上游引物:5'-CTTGACGGAGCGTGGTTATT-3'下游引物:5'-ACCGATGGTGATTACTTGACC-3'

1．2．2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol試劑從嗜蟲(chóng)書(shū)虱體內(nèi)提取總RNA，所有操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;cDNA合成按Prime-ScriptTMRT－PCR Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．2．3 PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

利用上述簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，利用膠回收試劑盒對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物克隆到pMD18－T質(zhì)粒載體中，用通用引物進(jìn)行序列測(cè)定，所有測(cè)序工作由上海英俊生物公司完成。

1．2．4 序列分析

多重序列比對(duì)和氨基酸序列的推導(dǎo)使用DNAMAN軟件完成，BLAST同源性搜索在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點(diǎn)完成。

1．2．5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件的優(yōu)化

采用SYBR Green I染料法，在Mx3000PTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，以最小的Ct值和最高的熒光值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1．2．6 熔解曲線分析

為排除形成二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果造成影響的可能性，在PCR后進(jìn)行熔解曲線分析，以確定得到的產(chǎn)物為單一的目的產(chǎn)物。溫度以0．5℃/10 s的速度從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。

1．2．7 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用上述定量PCR引物對(duì)嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，利用膠回收試劑盒對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行回收純化。對(duì)純化的目的片段進(jìn)行5倍系列稀釋，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，以相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2．1 嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因cDNA片段的克隆及序列分析

圖1 嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因片段核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 嗜蟲(chóng)書(shū)虱與其它昆蟲(chóng)β－actin基因片段核苷酸序列的多重比對(duì)

以抽提的嗜蟲(chóng)書(shū)虱總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了一條約為820bp的基因片段，經(jīng)酶切和PCR鑒定后進(jìn)行基因序列測(cè)定，得到嗜蟲(chóng)書(shū)虱βactin基因 cDNA的片段(GenBank登錄號(hào):FJ 041117)。該基因片段長(zhǎng)度為822 bp，編碼273個(gè)氨基酸殘基(從第3個(gè)堿基開(kāi)始編碼)，其核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖1。將嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因的核苷酸序列進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因與其他昆蟲(chóng)的β－actin具有很高的同源性，它與小眼書(shū)虱(Liposcelis paeta，GQ449384)、嗜卷書(shū)虱(Liposcelis bostrychophila，F(xiàn)J196622)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，DQ440059)、家 蠶 (Bombyx mori，HQ918291)、白紋伊蚊(Aedes albopictus，DQ657949)、美國(guó)牧草盲蝽(Lygus Lineolaris，DQ386914)的β－ac-tin同源性分別高達(dá)89%、88%、83%、83%、83%和84%，表明該基因在不同物種間具有高度的保守性(圖2)。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行5倍系列稀釋，采用優(yōu)化的條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以Ct值為縱坐標(biāo)，以相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，結(jié)果表明，本方法有很好的相關(guān)性，其 Ct值與模板濃度的回歸方程為Y= －1．426Log(x)+21．42，Y 為 Ct值，x為模板濃度，其相關(guān)系數(shù)為0．989，擴(kuò)增效率為97．5%。

圖3 β－actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．3 熔解曲線

擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線只有一個(gè)特異峰，表明產(chǎn)物是唯一的，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的定量PCR引物具有很好的特異性，PCR反應(yīng)條件得到了較好的優(yōu)化。

圖4 熔解曲線分析

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，書(shū)虱作為一類重要的儲(chǔ)糧害蟲(chóng)引起科學(xué)家們的重視，對(duì)其研究也逐步深入到分子生物學(xué)領(lǐng)域［13］。Tang等從嗜蟲(chóng)書(shū)虱體內(nèi)克隆獲得了2條乙酰膽堿酯酶基因(AChE)［14］;Jiang等從嗜卷書(shū)虱體內(nèi)克隆獲得了2條多功能氧化酶基因(P450)，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較了2條基因在不同蟲(chóng)態(tài)之間的轉(zhuǎn)錄水平［15］;Wu等［16］從小眼書(shū)虱體內(nèi)克隆獲得了1條乙酰膽堿酯酶基因(AChE)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較不同地理品系之間的轉(zhuǎn)錄水平，研究其分子水平的多態(tài)性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以比較昆蟲(chóng)不同品系、不同組織或不同個(gè)體間基因表達(dá)的差異，從分子水平上揭示害蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生機(jī)理，以此建立抗藥性分子診斷技術(shù)，還可以針對(duì)變化了的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特定的靶標(biāo)殺蟲(chóng)劑，為有害生物的綜合治理提供技術(shù)支撐［17－20］。然而，目前尚未見(jiàn)到有關(guān)嗜蟲(chóng)書(shū)虱內(nèi)參基因的研究報(bào)道。為了給嗜蟲(chóng)書(shū)虱基因表達(dá)的定量分析提供必要的方法手段，本研究克隆獲得了嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因cDNA片段，并以此為內(nèi)參基因建立了基于SYBR Green染料技術(shù)的嗜蟲(chóng)書(shū)虱實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，利用嗜蟲(chóng)書(shū)虱β－actin基因(GenBank登錄號(hào):FJ041117)為內(nèi)參基因，利用本研究設(shè)計(jì)的定量PCR引物所建立的方法具有快速(從RNA提取到PCR結(jié)束在4 h內(nèi)完成)、高通量(一次可同時(shí)檢測(cè)90多個(gè)樣本)、線性范圍廣以及重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，從而為β－actin作為內(nèi)參基因?qū)κ认x(chóng)書(shū)虱相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析提供了有利的方法學(xué)基礎(chǔ)。

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Cloning of β－actin Gene and Establishment of Quantitative Real－time PCR from Liposcelis Entomophila

Tang Peian1Wang Jinjun2Song Wei1

(School of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics1，Nanjing 210003)

(Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering of Chongqing，Southwest University2，Chongqing 400716)

The purpose of this study was to establish a quantitative real－time PCR method for Liposcelis entomophila and provide useful methodological basis for quantitative analysis of L．entomophila genes．The sequence of the β－actin gene cDNA fragment of Liposcelis entomophila was amplified by reverse transcript polymerase chain reaction(RT－PCR)，which contained 822 base pairs(bp)and encoded 273 amino acid(GenBank accession number:FJ041117)．According to the sequence of β －actin gene above，a quantitative real－time PCR method based on SYBR Green I dye was developed．The results showed that the quantitative real－time PCR method established in the study had the advantages of high efficiency，wide linear range and less time．The results of this study might provide a basis for β － actin used as a reference gene to analyze the Liposcelis entomophila gene quantitatively．

Liposcelis entomophila，β－actin，quantitative real－time PCR，reference gene

Q786

A

1003－0174(2011)11－0071－05

時(shí)間:2011－10－25 10:17

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20111025．1017．002．html

CNKI:11 －2864/TS．20111025．1017．002

國(guó)家自然科學(xué)基金(31000828)

2011－01－18

唐培安，男，1981年出生，講師，儲(chǔ)藏物昆蟲(chóng)學(xué)