山藥糖蛋白純化條件及其理化方法鑒定

孫宇婧 韓 濤 卞 科 李麗萍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系1，北京 102206)

(陜西省榆林市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心2，榆林 719000)

(河南工業(yè)大學(xué)3，鄭州 450002)

(北京工商大學(xué)植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室4，北京 100037)

山藥糖蛋白純化條件及其理化方法鑒定

孫宇婧1，2韓 濤1卞 科3李麗萍4

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系1，北京 102206)

(陜西省榆林市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心2，榆林 719000)

(河南工業(yè)大學(xué)3，鄭州 450002)

(北京工商大學(xué)植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室4，北京 100037)

采用熱水浸提法得到山藥糖蛋白粗提物，經(jīng)過不同洗脫液進(jìn)行DEAE－52柱層析純化和SephadexG－75柱層析純化，得到山藥糖蛋白組分CYG－1和CYG－2。其中，DEAE－52柱層析中以NaHCO3作為洗脫液時，只能得到1個CYG組分。I2－KI顯色反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、硫酸－咔唑反應(yīng)、以及與FeCl3反應(yīng)和與CTAB反應(yīng)、糖肽鍵特征等理化方法鑒定的結(jié)果表明，得到的CYG－1和CYG－2為純品，屬酸性糖蛋白，糖肽鍵為O－糖肽鍵。CYG－1和CYG－2分子中蛋白和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20．62%、15．16%和68．56%、72．31%。

山藥 糖蛋白 純化 糖肽鍵

糖蛋白是一類由較短往往具有分支的寡糖鏈與蛋白質(zhì)(多肽鏈)共價相連而構(gòu)成的糖復(fù)合物［1－3］。對糖蛋白的藥理作用及保健功能研究已取得一些重要成果［4－5］，顯示了在新型藥物及功能性食品開發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

山藥又名白苕、土薯、大薯、薯藥，為薯蕷科(Dioscoreae opposite Thumb)多年生宿根蔓性草本植物的地下塊莖，多分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［6］，其性平味甘，健脾益肺，是我國傳統(tǒng)的藥食同源類植物。山藥主要含蛋白質(zhì)和淀粉，還含有比較豐富的維生素和多種礦物質(zhì)元素及黏液質(zhì)等活性成分，黏蛋白的氨基酸組成全面，人體必需氨基酸的含量比較高。有報道稱山藥糖蛋白具有增強(qiáng)人體免疫力、降低血糖、抗衰老、抗腫瘤、抗突變等功效，是山藥活性成份之一［7］。國外對山藥的研究較集中在山藥質(zhì)地結(jié)構(gòu)及加工性質(zhì)方面［8－9］，鮮見山藥糖蛋白研究，國內(nèi)關(guān)于山藥糖蛋白研究的全面報道也較少。

本試驗采取熱水浸提法抽提山藥糖蛋白，Sevag法除游離蛋白，再經(jīng)過DEAE－52和SephadexG－75柱層析進(jìn)行純化，并通過其理化性質(zhì)的分析，對所得到的山藥糖蛋白進(jìn)行鑒定，為今后開發(fā)山藥糖蛋白產(chǎn)品或進(jìn)行功能性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗原料

新鮮山藥:北京回龍觀鎮(zhèn)城北交易市場。

1．1．2 試劑與儀器

DEAE-52:Whatman公司;SephadexG-75:Pharmacia公司;透析袋(MwCo8000D):Sigma公司;乙醇、無水乙醚、丙酮等試劑均為分析純，北京化工廠。

RE52CS－1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;HL－24恒流泵:上海滬西分析儀器廠;TH－1000梯度混合器:上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司;BSZ－100自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TDL－40B離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。

1．2 方法

1．2．1 山藥糖蛋白的提取

山藥經(jīng)破碎勻漿，65℃熱水浸提，離心收集上清液，減壓濃縮，用4倍體積的95%乙醇沉淀，收集沉淀復(fù)溶，淀粉酶除淀粉，Sevag法除游離蛋白，再用無水乙醇沉淀，依次用無水乙醚、丙酮洗滌2～3次，最后經(jīng)低溫干燥得糖蛋白粗提物。

1．2．2 DEAE －52柱層析純化

DEAE－52纖維素50 g于25℃環(huán)境中，用10倍體積的蒸餾水浸泡24 h。充分溶脹后，用蒸餾水反復(fù)洗滌，傾去懸浮顆粒;抽濾后再用0．5 mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌片刻，自然沉降后，用蒸餾水洗滌至中性;然后用0．5 mol/L HCl浸泡，攪拌片刻，自然沉降后，用蒸餾水洗滌至中性;最后用0．5 mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌片刻，自然沉降后，用蒸餾水洗滌至中性。經(jīng)過“堿、酸、堿”處理后的纖維素將結(jié)合OH－，可與帶負(fù)電荷的糖蛋白陰離子進(jìn)行交換。處理后的DEAE－52纖維素濕法裝柱(離子交換柱規(guī)格:1．6 cm ×40 cm)，再用蒸餾水平衡 3 d［10］。

將山藥糖蛋白粗提物配制成質(zhì)量濃度為5．0 mg/mL的樣液，上樣量5mL，分別采用 NaHCO3和NaCl進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為 0．5 mL/min，3 mL/管。采用苯酚－濃硫酸法分別檢測280 nm和490 nm處的吸收峰，收集并合并兩波長處同時具有吸收峰的組分，透析后干燥并收集，得到糖蛋白純品(CYG)。

1．2．3 SephadexG －75 柱層析

SephadexG－75層析柱的制備:將SephadexG－75干粉浸泡在10倍體積的0．02 mol/L pH 7．2的Tris－HCl緩沖溶液，沸水浴中逐漸加熱使之充分溶脹，約需8～12 h，然后用自然沉降法裝柱，0．02 mol/L pH 7．2 Tris－HCl緩沖溶液平衡 3 d。

1．0 cm×70 cm的層析柱，濕法裝柱，用蒸餾水平衡2 d。將經(jīng)過DEAE－52層析得到的山藥糖蛋白純品配成1．0 mg/mL，樣液上樣量為5 mL。用蒸餾水作洗脫液，洗脫速度為1 mL/min，3 mL/管。同1．2．2中方法，采用苯酚－濃硫酸法在280 nm和490 nm波長下追蹤，將兩波長處同時具有吸收峰的相應(yīng)組分收集合并，濃縮、透析，干燥后備用。

1．2．4 山藥糖蛋白的理化方法鑒定

1．2．4．1 化學(xué)方法鑒定

碘－碘化鉀反應(yīng)［11］:分別把結(jié)晶碘5 g，碘化鉀10 g，定容至500 mL，貯于棕色瓶內(nèi)。配制10 mg/mL的山藥糖蛋白分別等量置于兩管，加入I2－KI溶液，并觀察顏色變化。

茚三酮反應(yīng)［12］:稱取5 g茚三酮，用125 mL沸蒸餾水溶解，冷卻后備用。配制10 mg/mL的山藥糖蛋白，加入茚三酮溶液，混勻，觀察顏色變化。

斐林試劑反應(yīng)［12］:在10 mg/mL的山藥糖蛋白溶液中加入由0．1 g/mL NaOH溶液和0．05 g/mL硫酸銅溶液配制而成的斐林試劑，觀察顏色變化。

硫酸 －咔唑反應(yīng)［13］:配制 0．1%咔唑試液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇中)，取0．2 mL山藥糖蛋白樣品液，補(bǔ)水至1 mL，在冰水浴中加入6 mL濃H2SO4，搖勻后，在85℃水浴中保持20 min，取出后冷至室溫，加0．2 mL咔唑液，在室溫下保持2 h，觀察顏色變化。

三氯化鐵反應(yīng)［14］:稱取 4．5 g 三氯化鐵，用 32%鹽酸溶液與水(1∶39)的混合液溶解，定容至100 mL，加入山藥糖蛋白樣品液，觀察顏色變化。

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)絡(luò)合反應(yīng)［14］:稱取CTAB 5 g，加到已標(biāo)定好的0．125 mol/L H2SO4溶液250 mL中，混勻，加入山藥糖蛋白樣品液，煮沸2 h，觀察顏色變化。

1．2．4．2 糖蛋白糖肽鍵特征

3.1 以供給側(cè)改革為導(dǎo)向，優(yōu)化資源配置 隨著越來越多的社會企業(yè)積極參與特色小鎮(zhèn)的建設(shè)，從頂層設(shè)計、金融支持、開發(fā)建設(shè)和運營管理等多個方面暴露出了當(dāng)前我國特色小鎮(zhèn)建設(shè)地產(chǎn)化、文化流失、布局不合理等諸多問題[10]。針對這些問題，在以供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革為導(dǎo)向下優(yōu)化資源配置就顯得尤為重要。

紫外光譜法［7，15］:稱取5 mg 糖蛋白溶于3 mL 蒸餾水中，分成兩等份，其中一份加入1．5 mL蒸餾水，另一份加入1．5 mL 0．4 mol/L NaOH溶液，測反應(yīng)開始和結(jié)束時(2 h)的紫外光譜，并記錄開始與結(jié)束時240 nm處的吸光值。

1．2．5 糖蛋白中多糖含量與蛋白質(zhì)含量的測定

苯酚－硫酸法［16］，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品;Folin－酚法［17］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

以上所有試驗和測定均為3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 山藥糖蛋白粗提物DEAE－52柱層析結(jié)果

2．1．1 不同濃度NaHCO3溶液洗脫結(jié)果

用收集洗脫液的時間作為橫坐標(biāo)，分別以每一管洗脫液的OD280nm(紫外分光法測定蛋白質(zhì))和OD490nm(苯酚－硫酸法測定多糖)吸光值為縱坐標(biāo)，繪制出DEAE－52層析柱洗脫曲線圖，見圖1。

圖1 山藥糖蛋白DEAE－52NaHCO3溶液洗脫曲線

用DEAE－52纖維素柱層析純化糖蛋白可選用的洗脫液有蒸餾水、不同濃度的 NaHCO3溶液及NaCl溶液。用蒸餾水洗脫時，由于蒸餾水與DEAE－52纖維素之間不存在離子交換，因此可洗脫出不被吸附的糖蛋白，即不帶電荷的中性糖蛋白。用NaHCO3溶液洗脫時可置換出被纖維素上陽離子基團(tuán)吸附的帶負(fù)電荷的糖蛋白，即酸性糖蛋白;隨著溶液濃度的升高，HCO3－濃度及溶液的pH都升高，這對洗脫酸性糖蛋白更為有利［19］。因此先用 0．05、0．10、0．50 mol/L的NaHCO3溶液進(jìn)行階段洗脫試驗(圖1)。在 OD280nm下時間段為36～96 min、108～144 min出現(xiàn)明顯洗脫峰，而在OD490nm下時間段為54～132 min、180～216 min、216～246 min出現(xiàn)洗脫峰，其中第1個洗脫峰在280 nm和490 nm處的吸收峰重疊，為糖蛋白的特征吸收，表明該洗脫組分可能為糖蛋白;其余吸收峰則無此特征，可能為未除盡的游離蛋白質(zhì)。

從圖2可看出，洗脫液在OD490nm處有3個吸收峰，在OD280nm出有2個吸收峰，其中24～36 min時出現(xiàn)的吸收峰只在OD490nm處有吸收峰，在OD280nm處沒有吸收峰。而在48～78 min時洗脫液在OD280nm和OD490nm處都有吸收峰，在138～186 min時洗脫液中也有一個二者共同出現(xiàn)的吸收峰。在相同組分中既含有多糖又含有蛋白質(zhì)，可以認(rèn)定該組分為糖蛋白。因此山藥糖蛋白經(jīng)過DEAE－52纖維素陰離子交換柱層析后，分離出2個糖蛋白峰，暫分別稱為CYG－1和CYG－2。

圖2 山藥糖蛋白DEAE－52NaCl溶液洗脫曲線

2．2 山藥糖蛋白粗品SephadexG－75柱層析結(jié)果

經(jīng)DEAE－52柱層析純化得到的2個山藥糖蛋白組分(CYG－1和CYG－2)，再分別用SephadexG－75葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)一步純化。

2．2．1 CYG －1的 SephadexG －75柱層析結(jié)果

山藥糖蛋白1(CYG－1)經(jīng)SephadexG－75層析柱純化后，在第24～45 min時OD280nm和OD490nm的洗脫液中同時出現(xiàn)了多糖和蛋白質(zhì)的吸收峰，且吸收峰單一，峰形基本對稱，表明組分均一(圖3)。

圖3 山藥糖蛋白(CYG－1)SephadexG－75蒸餾水洗脫曲線

2．2．2 CYG －2的 SephadexG －75柱層析結(jié)果

山藥糖蛋白2(CYG－2)經(jīng)過SephadexG－75層析柱純化時，在33～57 min時OD280nm和OD490nm同時出現(xiàn)了多糖和蛋白質(zhì)的吸收峰，吸收峰單一且峰形對應(yīng)，無拖尾現(xiàn)象(圖4)。

圖4 山藥糖蛋白(CYG－2)SephadexG－75蒸餾水洗脫曲線

2．3 山藥糖蛋白理化方法鑒定結(jié)果

2．3．1 定性試驗

山藥糖蛋白溶液與I2－KI不顯色，表明其是非淀粉類多糖;山藥糖蛋白溶液與茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)紫色，表明其有蛋白質(zhì)存在;山藥糖蛋白溶液與斐林試劑反應(yīng)，沒有銀鏡產(chǎn)生，表明其不含游離單糖;硫酸－咔唑反應(yīng)沒有呈現(xiàn)綠色，表明山藥糖蛋白不含糖醛酸;山藥糖蛋白溶液與FeCl3反應(yīng)未呈現(xiàn)藍(lán)色沉淀，表明其不含多酚類物質(zhì);山藥糖蛋白與CTAB反應(yīng)呈黃色，表明其是酸性糖蛋白。

2．3．2 糖肽鍵特征

堿性β－消除反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于闡明糖蛋白的結(jié)構(gòu)，當(dāng)糖蛋白受溫和的堿處理時，由于糖與蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸的β－位羥基之間形成的O－糖肽鍵對堿不穩(wěn)定，而N－糖肽鍵是穩(wěn)定的，因此可以通過堿處理后糖蛋白中絲氨酸和蘇氨酸殘基數(shù)的減少來確定O－糖肽鍵的存在［10］。

等量的山藥糖蛋白中分別加入蒸餾水與0．4 mol/L NaOH，其反應(yīng)開始和2．0 h后的紫外光譜見圖5，處理開始和結(jié)束時在240 nm處的吸光度值變化見表1。

圖5 山藥糖蛋白CYG－1和CYG－2的β－消除反應(yīng)前后紫外圖譜

表1 山藥糖蛋白CYG－X經(jīng)蒸餾水和NaOH處理始末的紫外(240 nm)吸收值變化

由圖5及表1可知，反應(yīng)開始時山藥糖蛋白2組分在280 nm處均有吸收峰，這表明了糖蛋白的特征吸收峰。反應(yīng)結(jié)束時，2個經(jīng)水處理的山藥糖蛋白在240 nm處沒有吸收峰，但經(jīng)堿處理過的山藥糖蛋白均在240 nm處產(chǎn)生明顯吸收，表明這2個山藥糖蛋白組分中均具有O－糖肽鍵。綜合試驗結(jié)果，表明得到的2個山藥糖蛋白為純度較高的酸性糖蛋白。

2．4 山藥糖蛋白中多糖與蛋白質(zhì)的含量

由圖6可知，CYG－1和CYG－2分子中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20．62%、15．16%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為68．56%、72．31%。山藥糖蛋白分子中多糖與蛋白質(zhì)組成的差異可能與其功能性質(zhì)有關(guān)。2個山藥糖蛋白分子中均含有除蛋白質(zhì)和多糖以外的部分，分別占10．82%和12．55%，它們的組成和對糖蛋白的功能性質(zhì)的影響尚不清楚。

圖6 山藥糖蛋白中多糖與蛋白質(zhì)組成

3 討論與結(jié)論

本研究采用了DEAE－52和SephadexG－75兩種柱層析法對山藥糖蛋白粗品進(jìn)行純化，其中在DEAE－52柱層析時，選取NaHCO3和NaCl兩種洗脫液分別對山藥糖蛋白進(jìn)行洗脫，NaHCO3洗脫只得到1個組分，而NaCl洗脫得到的是2個重疊峰，可確定為CYG－1和CYG－2，這與丁青芝等［18］在山藥糖蛋白分離純化與鑒定中的結(jié)果基本相近。進(jìn)而通過一系列試驗進(jìn)一步鑒定了純化得到的山藥糖蛋白為純品，且糖肽鍵特征分析結(jié)果表明山藥糖蛋白的糖肽鍵是O－糖肽鍵，這與曾麒燕等［15］研究紅桂木凝集素糖蛋白特征及其糖肽鍵性質(zhì)的分析結(jié)果相似。

在DEAE－52柱層析純化中分別使用NaHCO3和NaCl對山藥糖蛋白粗提物進(jìn)行洗脫，前者為堿性洗脫劑，酸性山藥糖蛋白可能被中和，與填充物的吸附作用減弱，CYG－1和CYG－2一同被洗脫下來，故只得到1個組分;后者為中性洗脫劑，CYG－1和CYG－2與填充物之間吸附作用能力的差異導(dǎo)致它們分別被洗脫下來，故得到2個組分。在隨后的SephadexG－75柱層析中，進(jìn)一步證明了它們是單一的組分。

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Purification Conditions and Physical and Chemical Identification of Chinese Yam Glycoprotein

Sun Yujing1，2Han Tao1Bian Ke3Li Liping4

(Department of Food Science，Beijing University of Agriculture1，Beijing 102206)
(Agri－ Food Quality ＆ Safety Testing Center，Yulin，Shaanxi2，Yulin 719000)
(Henan University of Industry3，Zhengzhou 450002)
(Beijing Plant Resources Research and Development Major Laboratory，Beijing Technology ＆ Business University4，Beijing 100037)

Extracted crude glycoprotein from Chinese yam tuber was exposed for purification with DEAE－52 and Sephadex G －75 column chromatography．2 pieces of Chinese yam glycoprotein were obtained by the elution with NaCl solution，i．e．CYG －1 and CYG －2，but only one with NaHCO3solution．A couple of physical and chemical tests for identification were conducted on CYG －1 and CYG －2．The results showed that both of them were pure and acidic glycoprotein．The bonds connecting peptide and polysaccharides in CYG －1 and CYG －2 were O －type．The contents of protein or polysaccharide in them were 20．62%and 15．16%or 68．56%and 72．31%，respectively．

Chinese yam，glycoprotein，purification

TS209

A

1003－0174(2011)03－0081－05

農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程北京市重點建設(shè)學(xué)科(PXM 2009－014207－078172)

2010－01－29

孫宇婧，女，1986年出生，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程

韓濤，男，1963年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程