大米濃縮蛋白酶法改性與功能性質(zhì)評價(jià)

劉 驥，唐俊妮

(西南民族大學(xué)，四川成都610041)

大米濃縮蛋白酶法改性與功能性質(zhì)評價(jià)

劉 驥，唐俊妮*

(西南民族大學(xué)，四川成都610041)

以大米濃縮蛋白(rice protein concentrate，RPC)為原料，利用堿性蛋白酶(Alcalase)改性。探討了在最適條件下，即底物濃度5%、酶與底物比例0.8%、pH8.5、55℃，經(jīng)過改性制得改性大米濃縮蛋白(modified rice protein concentrate，MRPC)的功能性質(zhì):氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%、乳化活性(EA=0.101)、乳化穩(wěn)定性(ES=26.7%)、表面疏水性(2627.6)以及分子量分布。研究表明，經(jīng)過Alcalase改性后的MRPC與大豆分離蛋白接近，具有作為食品蛋白質(zhì)添加劑開發(fā)的潛力。

大米濃縮蛋白，堿性蛋白酶，改性，功能性質(zhì)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米濃縮蛋白(RPC) 制備方法見參考文獻(xiàn)［3］，制得RPC溶解性小于0.5%;各類食品級蛋白酶制劑 包括:Neutrase、Alcalase、Protamex和胰蛋白酶Novo，由丹麥Novozymes提供;Papain木瓜蛋白酶 上海聚源生物工程公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

CS501型超級恒溫水浴 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠; PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;94-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器 上海志威電器有限公司;250mL玻璃夾套酶反應(yīng)器 循環(huán)水恒溫，定做;ALPHA 1-4型冷凍干燥機(jī) 德國制造;722型光柵分光光度計(jì)無錫科達(dá)智能儀器廠;Waters 2790高效液相色譜儀Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1.1 不同蛋白酶對于RPC增溶的效率 各種食品級蛋白酶在說明書推薦最適作用條件下作用于RPC，底物(RPC)濃度為5%，其它條件如下:a.胰蛋白酶Novo:E∶S=2%，pH8.0，45℃;b.Protamex:E∶S= 1%，pH7.0，40℃;c.Neutrase:E∶S=2%，pH7.0，40℃; d.Papain木瓜蛋白酶:E∶S=2%，pH7.0，40℃; e.Alcalase:E∶S=0.8%，pH8.5，40℃。酶反應(yīng)過程中，用pH-stat法控制反應(yīng)體系pH在該種酶的最適pH。取上清液通過Folin-酚比色測定不同酶反應(yīng)時(shí)間的蛋白溶出率。

1.2.1.2 Alcalase改性蛋白最適反應(yīng)條件 參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.2 MRPC功能性質(zhì)評價(jià)

1.2.2.1 MRPC的溶解性 依據(jù)C.V.Morr［10］的方法略做修改:取1g的RPC，加入50mL水，用0.1N HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，25℃，攪拌1h，定容至100mL，離心(3000r/min，20min)，收集上清液，通過Folin-酚比色測定經(jīng)過不同水解時(shí)間后，改性蛋白在不同pH時(shí)的溶解性，以及改性蛋白等電點(diǎn)的溶解性。Folin-酚比色法結(jié)果用溶出蛋白量(mg/mL)表示。

1.2.2.2 MRPC的乳化活性 采用濁度法，利用乳化界面的面積與渾濁度存在簡單相關(guān)關(guān)系的原理。配制濃度為0.2%的蛋白質(zhì)溶液(pH的混合磷酸鹽緩沖液)，取75mL該溶液，加入25mL大豆色拉油，在10000r/min下均質(zhì)2min，用微量取樣器迅速從底部取乳化液10μL稀釋于5mL的0.1%SDS溶液中，以0.1%SDS溶液為參比，立即用分光光度計(jì)在500nm測定吸光值(A)，乳化活性(EA)用吸光值表示。

1.2.2.3 MRPC的乳化穩(wěn)定性 測定乳化活性后的乳液在80℃水浴中加熱30min，冷卻至室溫，搖勻，按上述方法測定乳化活性(EA80)，按下式計(jì)算乳化穩(wěn)定性:乳化穩(wěn)定性(ES，%)=EA80/EA

1.2.2.4 MRPC的表面疏水性 將水解不同時(shí)間的蛋白水解液滅酶，離心，取上清，用0.01mol/L、pH7.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液稀釋至0.002%、0.004%、0.008%、0.016%，取20μL 1-anilino-8-naphthalene溶液(8mmol/L溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)加入4mL上述配制的蛋白溶液(注意避光)，立即搖勻，在熒光分光光度計(jì)中于390nm激發(fā)，470nm檢測發(fā)射熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對蛋白溶液濃度作圖并進(jìn)行線性回歸，以線性回歸斜率作為表面疏水性的指標(biāo)。

1.2.2.5 MRPC的分子量分布 采用高壓液相(HPLC)測定MRPC分子量分布:將水解不同時(shí)間的蛋白水解液滅酶，離心，取上清，過0.45μm微孔濾膜，進(jìn)高效凝膠柱Protein KW-803。洗脫液0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.3mol/L NaCl)，流速1mL/min，紫外檢測波長280nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶對RPC增溶效率

如圖1所示，Trypsin和Alcalase在反應(yīng)初期和反應(yīng)5h結(jié)束時(shí)，RPC溶出量明顯大于其它三種酶的作用效果。與Alcalase相比，在Trypsin作用下，反應(yīng)初期溶出速率較快(曲線斜率較大);在Alcalase作用下的反應(yīng)末期，溶出速率略大于Trypsin作用下的溶出速率。這種差異可能主要是由于Trypsin酶作用的專一性帶來的，在反應(yīng)初期易被Trypsin作用的敏感鍵(Arg和Lys的羧基參與形成的肽鍵)較多，且其水解產(chǎn)物的末端氨基酸側(cè)鏈帶電荷，因而更容易溶出。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這類肽鍵大量減少，因此，溶出速率明顯下降。然而Alcalase是一種專一性遠(yuǎn)不如Trypsin的肽鏈內(nèi)切酶，在反應(yīng)末期可能還剩下略多的敏感鍵(不局限于Arg和Lys的羧基參與形成的肽鍵)，所以在反應(yīng)末期Alcalase作用下，溶出速率略大(曲線斜率較大)。但是對于為什么反應(yīng)初期Alcalase作用下，溶出速率低于Trypsin作用下的溶出速率的問題，從敏感鍵的角度來看，反應(yīng)初期易被Alcalase作用的敏感鍵的數(shù)量有可能是大于易被Trypsin作用的敏感鍵數(shù)量，分析原因可能如下:蛋白酶法增溶反應(yīng)中，不能排除如下因素——即使有些肽鍵被蛋白酶作用斷裂，但是蛋白質(zhì)仍然可能保持在固相中并不溶出。所以，敏感鍵數(shù)量雖多，卻并不一定導(dǎo)致蛋白溶出速率更大。這也從一定程度上說明水解度(DH)不適合描述液固兩相反應(yīng)進(jìn)行的程度。為了工藝上能合理地控制這一條件下的水解反應(yīng)，并確定反應(yīng)的程度，在本研究中采用水解時(shí)間與蛋白溶出量關(guān)系來描述反應(yīng)進(jìn)程。

圖1 不同蛋白酶的增溶效率

綜合考慮生產(chǎn)成本的因素，Alcalase增溶效率較高且價(jià)格比Trypsin便宜，從工業(yè)應(yīng)用的角度選擇Alcalase更為有利。

2.2 MRPC的溶解性

圖2所示，經(jīng)過短時(shí)間Alcalase處理后的RPC，呈現(xiàn)典型的U型溶解曲線，隨著時(shí)間增加，U形的谷底緩慢消失，最后變?yōu)樵诓煌膒H下廣泛可溶。圖3表明等電點(diǎn)溶解性隨酶解時(shí)間增加而增加，在反應(yīng)最初10min時(shí)等電點(diǎn)溶解性增加較為顯著。隨著反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行至60min，等電點(diǎn)溶解性幾乎達(dá)到最高。綜上可知，僅從RPC增溶程度來看，水解60min可達(dá)到提高溶解性的基本要求，不需要水解300min，這樣可以降低生產(chǎn)成本。

測定經(jīng)過60min水解的RPC氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%，可見RPC改性后溶解性得到較大的提高(改性前NSI低于0.5%)，是一種有應(yīng)用潛力的食品蛋白添加劑。

2.3 MRPC的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

由圖4可見，隨著水解時(shí)間的增大，乳化活性先增大后減小，然后又略有增大，在維持較長一段時(shí)間的平衡后，在水解300min時(shí)乳化活性顯著增大。與之相反的是，乳化穩(wěn)定性先減小后增大，隨后再減小后增大，在水解300min時(shí)乳化穩(wěn)定性最小。值得注意的是，乳化活性的峰頂正好對應(yīng)乳化穩(wěn)定性的峰谷，而乳化活性的峰谷正好對應(yīng)乳化穩(wěn)定性的峰頂。這一對應(yīng)關(guān)系較好地說明良好的乳化活性劑未必同時(shí)是良好的乳化穩(wěn)定劑。這是因?yàn)榫哂辛己萌榛钚缘奈镔|(zhì)應(yīng)該能快速地?cái)U(kuò)散到界面上，相應(yīng)在界面上不會太穩(wěn)定。而具有良好乳化穩(wěn)定性的物質(zhì)，可能在界面上形成一層比較穩(wěn)定的膜，因此雖然難以快速地?cái)U(kuò)散并鋪展至界面(乳化活性差)，但是乳化穩(wěn)定性較好。

圖2 水解時(shí)間對RPC溶解性的影響

圖3 MRPC等電點(diǎn)溶解性

圖4 MRPC乳化性和乳化穩(wěn)定性與水解時(shí)間的關(guān)系

表1 改性RPC與大豆分離蛋白界面特性的比較a

與大豆分離蛋白對比發(fā)現(xiàn):在水解60min時(shí)，雖然MRPC乳化活性與乳化穩(wěn)定性較大豆蛋白略低，這可能與RPC溶解性較低有關(guān);但是仍然不失為一種有開發(fā)潛力的廉價(jià)的食品乳化劑。

2.4 MRPC的表面疏水性

圖5為MRPC的表面疏水性與水解時(shí)間的關(guān)系，總的看來，表面疏水性隨著水解的進(jìn)行呈下降趨勢，但是水解10min后表面疏水性基本不再變化。水解60min時(shí)的表面疏水性為2627.6。因此，可以使用蛋白酶水解的方式在一定程度上減小表面疏水性，提高溶解度。

圖5 RPC表面疏水性與水解時(shí)間的關(guān)系

2.5 改性后上清液中RPC的分子量分布

如圖6所示，隨水解時(shí)間增加，MRPC分子量分布有較明顯的變化，總的趨勢是高分子量部分減少，低分子量部分增大。未水解時(shí)(水解0min)，根據(jù)分子篩分離蛋白原則，分子量分布基本上可分為三個(gè)部分，分別為:F1(極高分子量組分)、F3(中等分子量組分)、F4(低分子量組分);水解最初(2min)時(shí)，F(xiàn)1消失，同時(shí)增加了一個(gè)較為明顯的F2(高分子量組分)部分，這很可能是F1以及不溶性RPC的水解產(chǎn)物;隨著水解的進(jìn)一步進(jìn)行，F(xiàn)2減少，相應(yīng)的F3增加;水解至60min時(shí)，F(xiàn)2減少較多，F(xiàn)4部分有所增加;最后在水解至300min時(shí)，F(xiàn)3和F4兩個(gè)部分為水解產(chǎn)物的主要部分。表2說明隨著水解的進(jìn)行，F(xiàn)2部分先增加后減少;F3呈先減少后增加的趨勢;F4部分隨水解時(shí)間的增加不斷增加。

圖6 不同水解時(shí)間改性后上清液中RPC分子量分布

表2 不同水解時(shí)間各部分水解產(chǎn)物的相對含量

3 結(jié)論

利用Alcalase在最適條件下，即底物濃度5%、酶與底物比例0.8%、pH8.5、55℃，改性大米濃縮蛋白(RPC)，得到產(chǎn)品MRPC氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%，乳化活性(EA)為0.101，乳化穩(wěn)定性(ES，%)為26.7%，與大豆分離蛋白接近;Alcalase作用可以降低大米濃縮蛋白的表面疏水性，同時(shí)改進(jìn)蛋白產(chǎn)品的分子量分布。如果結(jié)合其它改性方法，如高壓均質(zhì)及化學(xué)改性等方法，可以進(jìn)一步提高RPC的溶解性;對MRPC的水解產(chǎn)物進(jìn)一步利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)，可以改善RPC分子表面親水/疏水微區(qū)分布，提高乳化活性和乳化穩(wěn)定性。總之，改性大米濃縮蛋白(RPC)是一種具有開發(fā)潛力的功能性食品蛋白質(zhì)添加劑。

［1］Murata K，Tanaka Y，Kawaguchi T.Comparision between nutritional value of rice and wheat protein［J］.Nutrition Reports International，1973，22(6):93-96.

［2］王金華.兩種蛋白酶對米渣蛋白的酶促降解作用［J］.食品工業(yè)科技，2002，23(12):13-15.

［3］劉驥.姚惠源.陳正行.利用米渣為原料制備大米濃縮蛋白［J］.食品工業(yè)，2004，25(3):11-13.

［4］K C Chang，C C Lee，G Brown.Production and nutritional evaluation of high-protein rice flour［J］.J Food Sci，1986，51: 464-467.

［5］Jei-Fu SHAW，Jyh-Rong SHEU.Production of Highmaltose Syrup and flour from Rice by an Enzymatic Method［J］. Biosci Biotech Biochem，1992，56(7):1071-1073.

［6］Frederick F，Shih，Kim W Daigle.Use of Enzyme for the Separation of Protein from Rice Flour［J］.Cereal Chem，1997，74 (5):437-441.

［7］ Frederick F，Shih，Kim W Daigle.Preparation and characterization of rice protein isolates［J］.JAOCS，2000，77(8): 885-889.

［8］劉驥，鄧依.高溫液化工藝對大米蛋白溶解性的影響［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(6):18-21.

［9］劉驥，姚惠源，陳正行.米渣濃縮蛋白酶法增溶機(jī)理初探［J］.食品科學(xué)，2007，28(2):214-219.

［10］C V Morr，B German，J E Kinsella，et al.A collaborative study to develop a standardized food protein solubility procedure［J］.J Food Sci，1985，50(6):1715-1718.

［11］黃友如.醇洗豆粕對大豆分離蛋白的提取及其功能性質(zhì)的影響［D］.無錫:江南大學(xué)，2003:40-41.

Enzymatic modification of rice protein concentrate and functional properties of the hydrolysates

LIU Ji，TANG Jun-ni*
(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China)

A potential food protein additive of rice protein concentrate(RPC)，was modified by Alcalase at the optimal conditions(concentration of substrate 5%，the ratio of enzyme to substrate 0.8%，pH 8.5，55℃)to improve its functionality in food system.Our research revealed that the functionalities of RPC，including nitrogen solubility index(NSI=52.9%)，emulsifying activity(EA=0.101)，emulsifying stability(ES=26.7%)，surface hydrophobicity (2627.6)and distribution of molecule weight，were promoted by Alcalase hydrolysis and the application of MRPC was extended.

rice protein concentrate(RPC);Alcalase;modification;functionality

TS210.1

A

1002-0306(2011)08-0206-04

雖然大米蛋白的營養(yǎng)價(jià)值高于小麥蛋白質(zhì)［1］，但是由于大米中蛋白含量較低(6%～9%)，且主要是溶解性較差的谷蛋白和醇溶蛋白，因此從大米中直接提取米濃縮蛋白和分離蛋白成本太高，且蛋白產(chǎn)品的功能性質(zhì)也較差，無商業(yè)價(jià)值。研究證實(shí)，從米淀粉深加工的副產(chǎn)物米渣中制備大米濃縮或分離蛋白(純度達(dá)90%)，具有經(jīng)濟(jì)可行性［2-8］，但是由于米蛋白在淀粉高溫液化工藝過程中，受到長時(shí)間的熱處理，溶解性能顯著降低。為了進(jìn)一步提高從米渣中制備RPC在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍，應(yīng)對其進(jìn)行改性。酶反應(yīng)動力學(xué)研究表明，RPC在Alcalase作用下遵守液固兩相反應(yīng)的動力學(xué)。堿性蛋白酶(Alcalase)降解不溶性蛋白組分可能符合“Zipper Reaction”模型［9］。因此，用水解度(DH)表征水解反應(yīng)進(jìn)程受到限制。為了更好地控制這一條件下的水解反應(yīng)，并確定反應(yīng)的程度，在本研究中采用水解時(shí)間與蛋白溶出量的關(guān)系來描述反應(yīng)進(jìn)程。本研究針對從米淀粉深加工副產(chǎn)物中制備的RPC為原料，進(jìn)行蛋白酶法改性，并對改性產(chǎn)品功能性質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，研究高效廉價(jià)的改性方法，為進(jìn)一步拓寬大米蛋白應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2010-08-02 *通訊聯(lián)系人

劉驥(1978-)，男，碩士，講師，研究方向:食品資源開發(fā)與利用。

國家自然基金項(xiàng)目(31071515);西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(09NZYZJ04)。