多指標(biāo)成分分析確定山茱萸最佳采收期△

陳隨清，魏雅磊，王靜，陳磊磊，李君

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

多指標(biāo)成分分析確定山茱萸最佳采收期△

陳隨清*，魏雅磊，王靜，陳磊磊，李君

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

目的:分析河南、浙江、陜西3個產(chǎn)區(qū)山茱萸中主要化學(xué)物質(zhì)的積累規(guī)律，確定最佳采收期。方法分別對山茱萸樣品中的熊果酸、馬錢苷、鞣質(zhì)、多糖、總有機酸的含量以及醇浸物、水浸物等指標(biāo)進行測定，對測定結(jié)果進行主成分分析。結(jié)果3個產(chǎn)區(qū)不同生長期的山茱萸中主要化學(xué)物質(zhì)積累都具有一定的規(guī)律;山茱萸果樹生長年限對藥材質(zhì)量影響不大;果樹的大小年現(xiàn)象對藥材質(zhì)量影響也不明顯。結(jié)合當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)采收習(xí)慣，確定河南、浙江兩產(chǎn)區(qū)最佳采收期為10月下旬，陜西產(chǎn)區(qū)為10月中旬。結(jié)論研究結(jié)果為山茱萸傳統(tǒng)采收期提供了科學(xué)依據(jù)。

山茱萸;采收期;化學(xué)成分;主成分分析

山茱萸，又名山萸肉、萸肉、棗皮、藥棗等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉，具有補益肝腎，收澀固脫的功能[1]，是臨床常用中藥。現(xiàn)代研究證明，山茱萸中含有多種成分，如有機酸類、環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)、多糖、氨基酸、維生素及礦質(zhì)元素等，具有提高免疫力，降血糖，抗衰老等作用[2]，因此臨床用量很大。

山茱萸主產(chǎn)于我國的河南、浙江、陜西等省，四川、安徽、山東亦有栽培。隨著近幾年來我國農(nóng)村種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，山茱萸的栽培面積正在逐漸擴大，目前以河南省栽培的產(chǎn)量最大，是河南省的道地藥材。作為人工栽培的藥材，山茱萸缺乏綜合評價和分析藥材質(zhì)量的方法，采收期沒有統(tǒng)一規(guī)范。在河南、浙江、陜西3個山茱萸主產(chǎn)區(qū)，主要采收山茱萸成熟果，每年9月底至10月中旬，是山茱萸的采摘期，但缺乏科學(xué)研究依據(jù)。作者曾對山茱萸果實1年內(nèi)熊果酸、馬錢苷的動態(tài)積累規(guī)律進行了研究，初步研究了1年內(nèi)山茱萸果實中熊果酸、馬錢苷含量變化的規(guī)律[3]。為了科學(xué)評價山茱萸藥材的采收期，了解多年生木本果樹生長年限以及大小年現(xiàn)象對藥材質(zhì)量的影響，我們采用熊果酸、馬錢苷、總鞣質(zhì)、總多糖、總有機酸，以及醇溶性浸出物、水溶性浸出物等指標(biāo)，對1年內(nèi)山茱萸果實中化學(xué)成分動態(tài)積累規(guī)律、不同生長年限和不同生長年份山茱萸果實中化學(xué)成分的含量變化進行了研究，報道如下。

1 材料、儀器及試劑

1.1 材料

山茱萸藥材分別采自河南西峽、浙江臨安、陜西佛坪，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。研究3個產(chǎn)區(qū)不同采收時間化學(xué)成分含量的變化關(guān)系時選用河南、浙江、陜西3個產(chǎn)區(qū)30～50年樹齡的山茱萸，2007年8～10月采集山茱萸藥材樣品;研究3個產(chǎn)區(qū)不同生長年限山茱萸化學(xué)成分含量變化關(guān)系時，選用河南、浙江、陜西3個產(chǎn)區(qū)2008年10月采集的不同生長年限的山茱萸藥材樣品;研究3個產(chǎn)區(qū)連續(xù)3年山茱萸中化學(xué)成分含量的變化關(guān)系時，選用河南、浙江、陜西3個產(chǎn)區(qū)2007～2009年10月份采集的山茱萸藥材樣品。

1.2 儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-D型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)，DHG-9053A型干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備儀器廠)，ZK-82A型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)，AGLIENT8455型紫外 -可見分光光度計，BS224S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-20A型紫外檢測器，CTO-10ASVP型柱溫箱，CBM-102型工作站)，KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)，PHS-2C型pH計(上海大譜儀器有限公司)，磁力攪拌器;HH-S型恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.3 試劑

熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110742-200516);馬錢苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111640-200604);沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110831-200302)，干酪素(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)。甲醇、異丙醇、乙腈為色譜純(天津四友精細化學(xué)品有限公司)，所用其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 馬錢苷含量測定

采用《中國藥典》2005版一部山茱萸項下含量測定方法，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、 3、 4。

2.2 熊果酸含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS(4.0 mm×250 mm，5μm)，流動相:乙腈-甲醇-水-磷酸(60∶15∶25∶0.1)， 流速:1 mL·min-1， 檢測波長:213 nm，柱溫:25℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粗粉1 g，精密稱定，置索氏提取器內(nèi)，加乙醚適量，加熱回流提取4 h，提取液回收乙醚至干，殘渣加石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL(約浸泡2 min)，傾石油醚，殘渣加甲醇微熱使溶解，定量轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶內(nèi)，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

方法學(xué)考察該結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、3、 4。

2.3 多糖含量測定

稱取山茱萸粉末0.1 g，加入50 mL 80%乙醇溶液，振蕩3 h，取出后過濾。取濾渣吹干后加入50 mL蒸餾水，放置水浴鍋中溫浸1 h后過濾，取濾液15 mL用蒸餾水定容至50 mL。從中取2 mL置于10 mL的具塞試管中，加5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，加濃硫酸5 mL，靜置5 min，然后水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫，在484.4 nm處測定其吸光度。方法學(xué)考察該結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、3、4。

2.4 鞣質(zhì)含量測定

采用《中國藥典》2005版一部附錄X鞣質(zhì)含量測定法項下測定方法測定。方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、3、4。

2.5 總有機酸含量的測定

采用《中國藥典》2005版一部附錄Ⅷ電位滴定法和永停滴定法項下電位滴定法測定，以酒石酸計，測定有機酸含量，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、3、4。

2.6 水溶性浸出物的測定

采用《中國藥典》2005版附錄X浸出物測定法項下水溶性浸出物測定法冷浸法測定，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、3、4。

2.7 醇溶性浸出物的測定

采用《中國藥典》2005版附錄X浸出物測定法項下醇溶性浸出物測定法測定，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，測定結(jié)果見表1、3、4。

3 結(jié)果

3.1 3個產(chǎn)區(qū)不同采收時間山茱萸藥材各指標(biāo)成分測定結(jié)果

見表1。

表1 3個產(chǎn)區(qū)不同采收時間山茱萸藥材各指標(biāo)成分測定結(jié)果/%

3.1.1 主成分分析測定 主成分分析是從多個數(shù)值變量之間的相互關(guān)系入手，利用降維的思想，將多個變量化為少數(shù)幾個互不相關(guān)的綜合變量，最大限度地保留原樣本集所含的原始信息，使新變量成為原變量的線性組合，并尋求主成分來研究樣本的一種方法[4]。 本文參考文獻[5]運用 spss統(tǒng)計分析軟件對測定結(jié)果進行主成分分析。由于各指標(biāo)的量綱不同，在計算之前須先消除量綱的影響，所以需要將原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。各指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化之后，對指標(biāo)進行相關(guān)性分析，確定主成分個數(shù)及相關(guān)系數(shù)，然后就可以得出主成分表達式。本文中3個產(chǎn)地的藥材都提取了1個主成分，所以3個產(chǎn)區(qū)主成分表達式如下:

3.1.2 不同采收時間樣品綜合分析得分 根據(jù)3.1.1的主成分方程表達式，分別計算3個產(chǎn)區(qū)的藥材綜合得分并排序，結(jié)果見表2。

表2 3個產(chǎn)區(qū)不同采收時間藥材綜合分析得分結(jié)果

可以看出河南和浙江產(chǎn)區(qū)藥材得分最高者都在10月下旬，陜西產(chǎn)區(qū)藥材得分最高在10中旬。

3.2 3個產(chǎn)區(qū)不同生長年限山茱萸藥材化學(xué)成分含量的變化結(jié)果

見表3及圖1～3。

表3 3個產(chǎn)區(qū)不同生長年限山茱萸藥材中化學(xué)成分含量測定結(jié)果/%

圖1 河南不同生長年限山茱萸藥材中化學(xué)成分含量變化圖

圖2 陜西不同生長年限山茱萸藥材中化學(xué)成分含量變化圖

圖3 浙江不同生長年限山茱萸藥材中化學(xué)成分含量變化圖

對3個主產(chǎn)區(qū)的數(shù)據(jù)進行綜合比較，發(fā)現(xiàn)3個主產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同生長年限山茱萸藥材的馬錢苷、水溶性浸出物的含量都符合《中國藥典》2005版規(guī)定，因此，生長年限對山茱萸藥材的質(zhì)量影響不大，均可采收。陜西、河南的山茱萸藥材各指標(biāo)成分在30～50年有一個低谷;浙江山茱萸藥材的各成分在20～30年有一個低谷。初步分析，山茱萸在20～50年為盛果期，但是各指標(biāo)成分的含量都在低谷，可能與植物生長在旺盛時期，座果率較高，果實積累的有效成分較少有關(guān)。

3.3 3個產(chǎn)區(qū)2007～2009年同期山茱萸中化學(xué)成分含量的變化結(jié)果

見表4， 圖4～6。

圖4 河南2007～2009年山茱萸藥材中化學(xué)成分含量變化圖

表4 3個產(chǎn)區(qū)2007～2009年山茱萸中化學(xué)成分含量測定結(jié)果/%

圖5 陜西2007～2009年山茱萸藥材中化學(xué)成分含量變化圖

圖6 浙江2007～2009年山茱萸藥材中化學(xué)成分含量變化圖

參考表4及圖4～6，3個產(chǎn)區(qū)2007～2009年連續(xù)3年山茱萸藥材各化學(xué)成分含量沒有明顯差異。現(xiàn)在山茱萸果樹多為人工種植，或野生人工撫育，藥農(nóng)主動施肥、鋤草、農(nóng)藥防治病蟲害等情況比較普遍，山茱萸果樹產(chǎn)量自然的大小年現(xiàn)象已不明顯。

4 討論

4.1 主成分分析法確定最佳采收期

通過對河南、陜西、浙江3個主產(chǎn)區(qū)山茱萸7類化學(xué)物質(zhì)進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)3個產(chǎn)區(qū)的山茱萸藥材第一個特征因子皆為總有機酸，對確定1年內(nèi)最佳采收期的貢獻度最大，分別為96.0%(河南)，83.1%(陜西)，95.77%(浙江)。從表2可以看出，河南、浙江產(chǎn)區(qū)最佳采收期為10月下旬，陜西產(chǎn)區(qū)為10月中旬。本次實驗包含了山茱萸中7種化學(xué)物質(zhì)的最佳綜合信息，分析結(jié)果與山茱萸產(chǎn)區(qū)的實際生產(chǎn)情況和傳統(tǒng)經(jīng)驗也是一致的。山茱萸為成熟果肉入藥，傳統(tǒng)習(xí)慣為成熟果實除去果核后的果肉干燥入藥。從各種化學(xué)物質(zhì)含量測定結(jié)果可以看出，不同化學(xué)物質(zhì)在果實從青果到成熟過程中積累規(guī)律是不一樣的，有的趨于上升，有的下降，單一成分分析山茱萸的采收期是很困難的，本文采用主成分分析方法提取出7種化學(xué)物質(zhì)的綜合信息，得到最佳結(jié)果，為山茱萸的傳統(tǒng)采收期提供了科學(xué)依據(jù)。從地理分布看，陜西產(chǎn)區(qū)與河南、浙江產(chǎn)區(qū)相比，分布海拔更高，山茱萸成熟期也稍早，每年9月中旬至10月中旬山茱萸進入成熟期，傳統(tǒng)上10月下旬山茱萸采收結(jié)束;浙江、河南產(chǎn)區(qū)每年9月下旬山茱萸進入成熟期，傳統(tǒng)上10月底采收結(jié)束。

4.2 生長年限對藥材質(zhì)量的影響

山茱萸作為多年生木本植物，其生長年限是否對藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響，目前研究的尚少，從研究結(jié)果看，山茱萸生長年限對藥材質(zhì)量沒有明顯影響。但是我們也發(fā)現(xiàn)，有些木本藥用植物隨著生長年限延長，可見植株老化、死亡現(xiàn)象，如連翹、桃樹、杏樹等，果實的產(chǎn)量也會明顯降低，至于藥材的質(zhì)量沒有見研究報道，有待進一步研究。

4.3 植物結(jié)果 “大小年”現(xiàn)象對藥材質(zhì)量的影響

多年生木本植物，在自然生長條件下，果實的產(chǎn)量會有大小年之分，這是由于植物結(jié)果量較大，對植物本身和周圍環(huán)境消耗養(yǎng)分也較多，第2年植物營養(yǎng)成分減少，結(jié)果量降低，形成小年，如山茱萸、五味子、木瓜、梔子、連翹、桃、杏等都存在這種現(xiàn)象。植物結(jié)果 “大小年”現(xiàn)象對藥材質(zhì)量是否有影響，目前也未見有研究報道。從山茱萸研究情況分析，這種情況研究起來比較復(fù)雜。因為，一是植物結(jié)果受自然氣候影響較大，自然氣候適宜或形成災(zāi)害會導(dǎo)致 “大小年”;二是很多藥用植物目前為人工栽培或人工撫育，人工澆水、施肥等干預(yù)措施會使植物結(jié)果 “大小年”現(xiàn)象不明顯。所以，結(jié)合實際情況對野生藥材結(jié)果 “大小年”的檢測，對藥材質(zhì)量影響的研究才有意義。

總之，對于以果實、種子入藥的多年生木本植物而言，采收期的研究要比草本植物研究更復(fù)雜，建議加強這方面的研究，為中藥材的規(guī)范化種植、資源的開發(fā)利用和保護提供科學(xué)依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:26.

[2]楊劍芳，路福平，高文遠，等.山茱萸的化學(xué)、藥理及開發(fā)應(yīng)用研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2006，(12):127-131.

[3]陳隨清，楊晉，王利麗，等.山茱萸果實成熟前后熊果酸和馬錢素的含量變化[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2005，(1):38-39.

[4]于秀林，任雪松.多元統(tǒng)計分析[M].北京:中國統(tǒng)計出版社，1998:154-169.

[5]張文霖.主成分分析在SPSS中的操作應(yīng)用[J].市場研究，2005(12):31-34.

Determine the Optimal Collection Time of Corni Fructus by the Analysis of M any Target Components

CHEN Sui-qing， WEI Ya-lei， WANG Jing， CHEN Lei-lei， LIJun
(Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou450008，China)

Objective:To analysis accumulation rule of major chemical substances of Corni Fructus in three production areas of Henan，Zhejiang and Shanxi to determine the best harvest time.

Methods:Determining and analysing the content of ursolic acid， loganin， tannin， polysaccharide，total organic acids，water-soluble extract and ethanol-soluble extract of Corni Fructus samples.Results:There is a certain accumulation rule of major chemical substances of Corni Fructus in different growth period from three production areas.The growth age of Corni Fructus has little effect on the quality of medicines;good harvest or yield reduction of Corni Fructus has not obvious influence on the quality of medicines，too.Considering the local harvest habits traditionally，it approved that the best harvest period of Henan and Zhejiang is in late October and the best harvest of Shanxi is the mid of October.Conclusion:This result provides a scientific basis for the traditional harvest period of Corni Fructus.

Corni Fructus;Harvest period;Chemical composition;Principal component analysis

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2006BAI09B05-8，2006BAI06A15-3)

*陳隨清，Tel:(0371)65676686，E-mail:suiqingchen@sohu.com

2010-10-13)