抗生素微生物檢定二劑量管碟法常用菌種培養(yǎng)的研究

北京市豐臺區(qū)藥品檢驗所(100071) 李婧 杜娟 陳征

中國是抗生素使用大國，也是抗生素生產(chǎn)大國。

1 抗生素微生物檢定法的概述

抗生素是微生物在代謝中產(chǎn)生的具有抑制它種微生物生長活動、甚至殺滅它種微生物的化學物質(zhì)?？股匚⑸餀z定法是測定抗生素效價的基本方法。是在適宜的條件下，根據(jù)量反應平行線原理設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性（效價）的方法。藥典中規(guī)定的抗生素微生物檢定包括兩種方法，管碟法和濁度法。其中，管碟法是目前使用較多的方法。

管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。管碟法分為二劑量法和三劑量法。二劑量法是目前使用較多的方法。對于二劑量管碟法的準確性很重要的一個影響因素就是實驗菌，本文對實驗菌種的培養(yǎng)進行討論。

2 二劑量法管碟法操作步驟

2.1 菌種培養(yǎng)基本操作

2.1.1 菌種凍干粉的復狀 取凍干粉一支，加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基約0.5ml，將菌粉溶解后，轉(zhuǎn)移至9ml肉湯培養(yǎng)基中，用刻度管吹洗數(shù)次后，放入培養(yǎng)箱中，在各菌種相應的溫度下培養(yǎng) 20～24小時。為保證菌種的質(zhì)量，營養(yǎng)肉湯菌液需在24小時內(nèi)使用。

2.1.2 菌種傳代 用接種環(huán)蘸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基一環(huán)，在營養(yǎng)瓊脂斜面上均勻劃“之”字，然后放入培養(yǎng)箱中，在各菌種相應的溫度下培養(yǎng) 20小時～24小時。菌種斜面需每月傳代一次，以保證菌種的良好狀態(tài)。

2.1.3 科氏瓶培養(yǎng) 使用芽孢的菌種，需要進行長時間培養(yǎng)，且芽孢菌液可以保存較長時間，所以可以采用科氏瓶培養(yǎng)，以便得到更多高濃度的菌液。

根據(jù)菌種斜面的成長狀況，選取生長狀態(tài)較好的3～5支，每支斜面分別用約1ml滅菌水將菌苔洗下，并轉(zhuǎn)移至同一個營養(yǎng)瓊脂科氏瓶中，然后放入培養(yǎng)箱中，在各菌種相應的溫度下培養(yǎng)7天。

在進行科氏瓶培養(yǎng)時，科氏瓶中培養(yǎng)基應向上放置，并墊高瓶口使科氏瓶稍稍傾斜，使多余的水沉至瓶底，防止水分過多影響菌種的生長。

2.1.4 菌液的制備 向培養(yǎng)好的斜面或科氏瓶中加入1～10ml滅菌水（或生理鹽水），將菌層洗下，轉(zhuǎn)移至經(jīng)過滅菌處理的試管中，使用芽孢的菌種需要在70℃水浴中保溫30分鐘進行滅活后備用。

2.1.5 抗生素微生物檢定法常用菌種的培養(yǎng)條件 見附表。

2.2 菌種涂片的制備方法

2.2.1 涂片 涂片的整個操作過程需在酒精燈無菌圈內(nèi)進行。首先點燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈外焰下充分加熱滅菌，放涼，蘸取滅菌過的生理鹽水一環(huán)置一張經(jīng)滅菌的顯微載玻片上。再將接種環(huán)用酒精燈外焰加熱滅菌后，放涼，蘸取搖勻的菌液一環(huán)，涂置上述載玻片上的生理鹽水上，使菌液稀釋并涂抹均勻。然后將涂抹均勻的菌液時時置酒精燈火焰上加熱，是菌液蛋白質(zhì)凝固，待菌液干燥凝固之后涂片即制作完成。

2.2.2 染色 ①結晶紫染色。在片子上的菌膜處滴一滴結晶紫染色液，計時放置一分鐘，使染色液充分染色。②沖洗。待一分鐘計時結束，用純化水沖掉染色液。沖洗時注意，將涂片傾斜，自上而下沖洗。不能直接沖菌膜，否則可能導致菌膜固定不牢被沖掉。沖掉染色液后將片子晾干再進行下一步操作。③復染。在片子的菌膜處滴加一滴革蘭氏碘液，計時放置一分鐘，目的在于固定蛋白質(zhì)與結晶紫的結合。④沖洗。待一分鐘結束后及時用純化水沖洗掉復染液，并晾干。方法同第二步。⑤脫色。在片子的菌膜處滴加酒精一滴，環(huán)東片子，使染色劑顏色脫落。一般脫色進行30秒即可，也可根據(jù)脫色的情況而定，至洗脫染色液的顏色，但時間不宜太長。⑥沖洗。待一分鐘及時結束后用純化水沖洗掉復染液，并晾干。方法同第二步。

2.2.3 常用菌種的形態(tài) 包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌。見附圖1，2，3，4，5。

附表 抗生素微生物檢定法常用菌種的培養(yǎng)條件

2.3 雙碟的制備 取直徑約90mm、高16～17mm的平底雙碟，分別注入各品種抗生素標準規(guī)定項下經(jīng)過滅菌處理的熱培養(yǎng)基20ml，使其在碟底均勻攤布，將加好培養(yǎng)基的碟子放置在事先調(diào)整水平的實驗臺上，使碟內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻凝固并保持水平。另取相應經(jīng)過滅菌處理的熱培養(yǎng)基適量，用水浴放冷至適當溫度，然后加入相應的試驗菌，加菌量需要經(jīng)過預實驗，使標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm，搖勻后，在每一個鋪好底層的碟子中加入5ml的帶菌培養(yǎng)基，使其均勻攤布，放置在水平臺上，冷卻使培養(yǎng)基凝固，放置時間應不少于20分鐘。然后在每一雙碟中以等距離均勻放置4個不銹鋼小管，鋼管大小為內(nèi)徑6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外徑7.8±0.1mm，用陶瓦罐覆蓋備用。

2.4 標準品溶液和供試品溶液的制備 按照各品種抗生素標準規(guī)定，配制標準品和供試品溶液，使其濃度為1000單位/ml，然后按照《中國藥典》規(guī)定的各品種抗生素使用的緩沖液，將標準品和供試品溶液分步稀釋至合適的兩個濃度，高、低濃度的比例為2:1或4:1[1]。

2.5 滴加樣品 配制好合適濃度的供試品和標準品溶液后，按照SH、TH、TL、SL的順序，向制備好的雙碟中加入供試品溶液和標準品溶液，每批樣品的雙碟數(shù)量至少為4個。最后放入培養(yǎng)箱中，在合適的溫度下培養(yǎng)。

2.6 結果判定 雙碟經(jīng)過適宜的培養(yǎng)后，會產(chǎn)生4個抑菌圈，根據(jù)準品和供試品溶液產(chǎn)生抑菌圈的大小，可計算得出供試品的效價。為保證結果的準確可靠，要對參與計算的所有碟子進行統(tǒng)計學顯著性測驗和可信限的計算，在P>0.05，可信限率不大于5%的情況下，實驗結果才是有效的。

3 菌種對抗生素微生物檢定結果的影響

附圖1 枯草芽孢桿菌

附圖2 短小芽孢桿菌

在抗生素微生物檢定法的結果判定中，最主要的數(shù)據(jù)是抑菌圈的大小。影響抑菌圈大小的因素有很多，如抗生素的濃度，抗生素對試驗菌的敏感程度，培養(yǎng)時間，培養(yǎng)溫度，菌種的生長活力，菌液濃度等。諸多因素中，菌種的影響是比較大的。菌種的形態(tài)和活性，菌齡、菌液的濃度等都會對實驗結果產(chǎn)生影響。所以菌種培養(yǎng)的每一步都是實驗的關鍵，為保證實驗菌的狀態(tài)良好，還應做涂片，在顯微鏡下觀察菌種形態(tài)。

3.1 菌種形態(tài)、活力和菌齡的影響 ①菌種的形態(tài)不典型、活力不強或者菌齡過大會直接影響到抑菌圈的形態(tài)。②菌種的形態(tài)不佳，與典型菌種形態(tài)差異較大，或菌種活力不強，在培養(yǎng)基上生長稀疏。制成菌液后可能會造成對抗生素活力不夠，長出過大的抑菌圈，也可能會造成菌對抗生素不敏感，長出過小、甚至長不出抑菌圈。③菌齡過大就會使菌液中的代數(shù)過多，由于每代菌的活力不同，新生菌活力強，老代的菌相對活力較弱，在進行抗生素微生物檢定法時會長出雙圈或者抑菌圈的邊緣不清晰，這種情況下不能應用儀器測量。

3.2 菌液濃度的影響 菌液的濃度在《中國藥典》上有具體的規(guī)定，這是因為不同種類的抗生素對敏感菌的抑菌效力是不同的。同樣濃度的菌液，加入這種抗生素中能長出大小合適的圈，但是換另一種抗生素可能就不能長出大小適宜，甚至不能長出抑菌圈。所以，菌液的濃度是靠檢驗員在每次正式實驗之前通過預試，測定幾種不同濃度的菌液，通過預試結果總結出的一個最合適的濃度，因此，在此不能一概而論。

附圖3 金黃色葡萄球菌

附圖4 藤黃微球菌

附圖5 肺炎克雷伯菌