四黃湯對(duì)急性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究

蘇治合，溫 飛，蔡 栩，孫智娟，尹 嬌，秦 燕

（1.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；（2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

四黃湯對(duì)急性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究

蘇治合1，溫 飛1，蔡 栩1，孫智娟1，尹 嬌1，秦 燕2*

（1.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；（2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：探討四黃湯對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法：將60只小鼠隨機(jī)分為四組，正常對(duì)照組15只、模型組15只、四黃湯高劑量組15只（40 g/kg/d生藥）及四黃湯低劑量組15只（20 g/kg/d生藥）。模型組每天灌以相同容積的生理鹽水,連續(xù)2周。最后一次灌胃24 h后，除正常對(duì)照組外,所有小鼠以CCl（40.1%10 mL/kg）腹腔注射，禁食不禁水8 h后斷頭取血及肝臟，檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的活性；部分肝組織制備肝勻漿，檢測(cè)丙二醛（MDA）的含量，同時(shí)取相同部位的肝組織制備病理切片，觀察小鼠肝組織損傷的程度。結(jié)果：急性肝損傷模型組血清ALT的含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量干預(yù)組血清ALT的含量則低于模型組（P＜0.05），而高劑量干預(yù)組血清ALT含量則較模型組偏高（P＜0.05）；模型組肝組織MDA含量高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量及高劑量干預(yù)組肝組織MDA的含量低于模型組（P＜0.05）。光鏡下四黃湯低劑量干預(yù)組肝細(xì)胞損傷程度較急性肝損傷模型組減輕。結(jié)論：四黃湯對(duì)小鼠的急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

四黃湯；急性肝損傷；保護(hù)作用

急性肝損傷是多種肝病發(fā)生、發(fā)展，最終走向肝功能衰竭的始動(dòng)環(huán)節(jié)和共同途徑，深入研究其發(fā)病機(jī)制及防治新思路對(duì)臨床治療肝損傷具有重要的指導(dǎo)意義。肝損傷的發(fā)生與肝細(xì)胞膜改變，自由基生成過(guò)多和脂質(zhì)過(guò)氧化有著密切聯(lián)系〔1-2〕。傳統(tǒng)中藥方劑四黃湯由黃芩、黃連、黃芪、生地黃等10味藥材組成。黃連、黃芩、黃芪具有疏肝解毒，攻積導(dǎo)滯、活血止血、滋陰補(bǔ)肝、息風(fēng)等之功效〔3〕。故本研究通過(guò)建立急性肝損傷的小鼠模型，觀察四黃湯對(duì)急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，肝組織丙二醛（MDA）含量以及肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，初步闡明四黃湯對(duì)急性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，為四黃湯的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 四黃湯由生地黃、黃芩、黃芪、黃連等10味中藥組成，生藥均購(gòu)自大理市東駿大藥房，煎煮后過(guò)濾、濃縮，置4℃冰箱備用。0.1%四氯化碳（CCl4）購(gòu)自成都市智遠(yuǎn)化工貿(mào)易有限公司，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雌性昆明小鼠，3～4月齡，共60只，由大理學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供。隨機(jī)分為4組，每組15只。其中模型組給予生理鹽水（0.2 mL/10g）灌胃；四黃湯低劑量組：每天灌胃0.2 mL/ 10g（含1 g/mL生藥）；高劑量組：每天灌胃0.2 mL/ 10g（含2 g/mL生藥），持續(xù)2周。最后一次灌藥24 h后，0.1%CCl4溶液行腹腔注射（0.1 mL/10g）。禁食不禁水8 h后斷頭取血及取肝臟，檢測(cè)血清ALT的活性；部分肝組織制備肝勻漿，檢測(cè)MDA含量。

1.3 主要儀器 RE5002（50 L）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司）；JY88-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）；TGL-18R（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平CVA214C（奧豪斯儀器上海有限公司）；電子制冰機(jī)Barline BF320（斯科茨曼制冰系統(tǒng)上海有限公司）。

1.4 病理切片 用10%中性福爾馬林固定肝組織，常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片。HE染色，觀察肝組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)均用單因素方差分析在SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行處理，結(jié)果用（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 四黃湯對(duì)急性肝損傷小鼠血清ALT及肝組織MDA含量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性肝損傷模型組血清ALT的含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量干預(yù)組血清ALT的含量則低于模型組（P＜0.05），而高劑量干預(yù)組血清ALT含量則較模型組偏高（P＜0.05）；模型組肝組織MDA含量高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量及高劑量干預(yù)組肝組織MDA的含量低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清ALT、肝組織丙二醛（MDA）含量的變化（±s，n=15）

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清ALT、肝組織丙二醛（MDA）含量的變化（±s，n=15）

注：與正常對(duì)照組比較：☆P＜0.05，與模型組比較：◆P＜0.05。

2.2 肝組織形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組肝小葉形態(tài)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常（見圖1）。急性肝損傷模型組可見肝小葉內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，肝細(xì)胞水腫（見圖2）。四黃湯低劑量干預(yù)組見肝小葉內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，與模型組相比炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯減少，仍可見肝細(xì)胞水腫（見圖3）。高劑量干預(yù)組肝細(xì)胞水腫較為明顯，中央靜脈周圍可見片狀肝細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞滲出不明顯（見圖4）。

圖1 正常對(duì)照組（HE×200）

圖2 模型組（HE×200）

圖3 低劑量干預(yù)組（HE×200）

圖4 高劑量干預(yù)組（HE×200）

3 討論：

CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是傳統(tǒng)的肝毒模型〔4〕。CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的機(jī)制與自由基生成及其啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)等有關(guān)。CCl4經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細(xì)胞色素氧化酶P450代謝分解產(chǎn)生三氯甲烷超氧自由基（CCl3O2-），CCl3O2-攻擊膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成大量的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致膜的流動(dòng)性和通透性改變，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和完整性，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損害〔5-7〕。

肝細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，ALT釋放入血，故血清中ALT含量在一定程度上反映了肝細(xì)胞受損程度，是反映肝損傷的敏感且最常用的指標(biāo)〔8〕。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，含量高低可反應(yīng)氧化的損傷程度〔9〕。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠血清ALT的含量明顯升高，提示模型組小鼠肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到損害，膜通透性明顯增加。與此同時(shí)肝組織MDA的水平也明顯升高，說(shuō)明CCl4在體內(nèi)引發(fā)一定量的氧自由基和一定程度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。低劑量四黃湯干預(yù)組小鼠，其血清ALT的水平較模型組明顯降低，而高劑量干預(yù)組小鼠血清ALT含量與模型組相比，數(shù)值反而升高，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P＜0.05），說(shuō)明一定量的四黃湯對(duì)急性肝損傷小鼠的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，但藥物劑量過(guò)大，可能對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使肝細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加重。模型組肝組織MDA含量高于正常對(duì)照組；而低、高劑量四黃湯干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，兩組均使小鼠肝組織的MDA含量明顯降低。肝組織病理改變也表明四黃湯干預(yù)后的肝組織形態(tài)學(xué)異常改變較模型組減輕，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也明顯減少。上述結(jié)果提示一定劑量的四黃湯可能通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜等途徑，發(fā)揮對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。但藥物劑量過(guò)大，則對(duì)小鼠肝臟有損害作用，這可能與四黃湯內(nèi)復(fù)雜的化學(xué)成分有關(guān)。因此，四黃湯對(duì)肝臟的作用實(shí)際是一把“雙刃劍”，有利有弊，如何正確把握劑量，使其揚(yáng)長(zhǎng)避短，更好地服務(wù)于臨床，還有待進(jìn)一步的研究。

〔1〕張錦雀，黃麗英.肝損傷動(dòng)物模型的研究進(jìn)展〔J〕.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，43（1）：86-88.

〔2〕沈洪，張蓓.急性肝損傷研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（18）：2211-2213.

〔3〕凌一揆.中藥學(xué)〔M〕.上海：上海科技出版社，1984，212-246.

〔4〕方清茂，張浩，曹毓.藏藥波棱瓜子提取物對(duì)肝損傷大鼠的抗氧化作用〔J〕.華西藥學(xué)雜志，2008，23（2）：147-149.

〔5〕Melin A M，Perromat A，Deleris G.Pharmacologic application of Fourier transform IR spectroscopy：in vivo toxicity of carbon tetrachloride on rat liver〔J〕.Biopolymers，2000，57（3）：160-168.

〔6〕Pramyothin P，Janthasoot W，PongnimitprasertN，et al. Hepatotoxin effect o（f+）usnic acid from Usnea siamensis Wainio in rats，isolated rat hepatocytes and isolated rat liver mitochondria〔J〕.J Ethnopharmacol，2004，90（2-3）：381-387.

〔7〕劉丹卓，趙新廣.肝損傷病因病理機(jī)制及中醫(yī)藥治療研究近況〔J〕.國(guó)醫(yī)論壇，2006，21（6）：53-55.

〔8〕李義奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991.

〔9〕張學(xué)武，樸龍，劉超，等.珍珠梅水提物對(duì)大鼠肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.世界華人消化雜志，2003，11（10）：1497-1499.

Protective Effect of Sihuangtang on Acute Hepatic Injury in Mice

SU Zhihe1,WEN Fei1,CAI Xu1,SUN Zhijuan1,YIN Jiao1,QIN Yan2*
（1.School of Clincal Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effect of Sihuangtang on acute hepatic injury in mice and its mechanism. Methods:Sixty mice were randomly divided into 4 groups each with 15,normal control group,model group,Sihuangtang high-dose group(40 g/kg/d crude),and Sihuangtang low-dose group(20 g/kg/d crude).Drug administration was conducted with gastric lavage in different dose everyday for 2 weeks in two treated groups,the same volume of normal saline was applied for model group.Twenty four hours after last gastric lavage,except normal control group,all mice were fasting for 8 hours and then euthanized with intraperitoneal injection of CCl4(0.1%10 mL/kilogram).The levels of alanine aminotransferase(ALT)in the serum,and malonaldehyde(MDA)in the liver were determined.And the pathological examination of liver tissue was observed by optical microscope.Results:The MDA level in the liver and the content of ALT in the serum of acute hepatic injury model group were significant higher than those in normal control group(P＜0.05);compared with the acute hepatic injury model group,the MDA levels in the liver in Sihuangtang low-dose and high-dosage group were both evidently decreased (P＜0.05);and the content of ALT in the serum of Sihuangtang low-dosage group was evidently decreased compared with the model group (P＜0.05),but the content of ALT in the serum increases in Sihuangtang high-dose group compared with the model group (P＜0.05).Under the optical microscope,liver cell injury of the low dose group was evidently slighter than that of the model group.Conclusion:Sihuangtang in certain concentration has protective effecton acute hepatic injury in mice.

Sihuangtang;acute hepatic injury;protective effect

R333.4［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1672-2345（2011）12-0044-03

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2010-089）。

2011-06-01

蘇治合，2007級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生.

*通信作者：秦燕，副教授.

（責(zé)任編輯 董 杰）