米渣谷蛋白的純化及功能性質研究

史蘇華，鄧 波，熊 華，杜研學，白春清，趙麗萍

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047)

米渣谷蛋白的純化及功能性質研究

史蘇華，鄧 波，熊 華*，杜研學，白春清，趙麗萍

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047)

按照Osborne蛋白分級提取渣蛋白，分別得到了清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，然后采用α-淀粉酶對谷蛋白進行純化，提純的谷蛋白純度可達到90%以上，進而研究食品體系中pH、鹽離子和多糖等因素對米渣谷蛋白溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響。pH在遠離等電點時，有利于谷蛋白的溶解，并提高了乳化性和乳化穩(wěn)定性;在0.5% NaCl溶液中，谷蛋白的溶解性和乳化性最大，而NaCl濃度為1.0%時，乳化穩(wěn)定性最低;卡拉膠的添加能顯著提高谷蛋白的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性，但過量的卡拉膠會破壞谷蛋白的乳化穩(wěn)定性。

米渣，谷蛋白，α-淀粉酶，溶解性，乳化性，乳化穩(wěn)定性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂米渣 江西恒天實業(yè)有限責任公司，蛋白質59.22%、水分6.23%、脂肪1.15%、灰分7.36%、粗纖維4.28%;石油醚、濃硫酸、氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉等 天津市大茂化學試劑廠，分析純;高溫α-淀粉酶 諾維信(中國)投資有限公司，酶活力單位為4000u/g。

KDY-9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司;T6紫外分光光度計 北京普析通用有限公司;冷凍干燥機FD-1 北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米渣中各蛋白組分的測定 米渣中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，根據它們在不同溶劑中的溶解性不同，參考Osborne的方法分別用25℃蒸餾水、5%NaCl、70%乙醇和0.1mol/L NaOH提取。工藝流程(每一步驟重復三次)如下:

分別合并三次的上清液，一部分采用考馬斯亮藍法［13］測定蛋白質濃度，另一部分透析除去小分子物質后，清、球和谷蛋白分別在等電點pH4.1、4.3和4.8沉淀，所有組分分別進行冷凍干燥。

1.2.2 α-淀粉酶法純化米渣谷蛋白 稱取100g脫脂米渣以液固比10mL/g溶于一定量的0.1mol/L NaOH溶液中，并置于50℃的水浴中浸提1h，將浸提液在4800r/min下離心10min，沉淀按上述方法重復提取兩次，合并三次的上清液，得到米渣谷蛋白粗提液。將米渣谷蛋白粗提液于水浴鍋中保溫至65℃，調pH至6.3(淀粉酶生產廠家推薦的最佳值)。加入一定量的α-淀粉酶，水解一段時間后調pH至4.8進行酸沉，將沉淀分別用5%NaCl、70%乙醇和蒸餾水洗滌3次，除去堿提過程中提取出的球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白以及殘留的無機鹽。再用0.1mol/L NaOH調pH至中性，然后進行冷凍干燥，最后得米渣谷蛋白粉。采用全自動凱氏定氮儀測定谷蛋白粉的蛋白含量，并計算谷蛋白提取率。

1.2.3 米渣谷蛋白的溶解性 稱取一定質量的米渣谷蛋白置于不同pH的緩沖液、不同鹽離子濃度和不同多糖濃度的去離子水中，在常溫下攪拌1h后，在10000r/min轉速下離心10min，收集上清液，用考馬斯亮藍法測定其中蛋白質濃度，以谷蛋白的氮溶解指數(Nitrogen Soluble Index，NSI)來表示蛋白質的溶解度。

1.2.4 米渣谷蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性 稱取米渣谷蛋白，溶解到于不同pH的緩沖液以及不同鹽離子濃度和不同多糖濃度的蒸餾水中，配成蛋白濃度0.1%的溶液。在設定溫度下攪拌1h后，取9mL蛋白溶液與1mL大豆油混合，放入40mL離心管中。在機械乳化機下乳化1min(12000r/min)，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中。取樣點固定在離燒杯底部0.5cm處，取50μL的乳化液與5mL 0.1%的SDS混合，在500nm處測定，用0.1%的SDS做空白對照［14］。以乳化活力指數(Emulsification Activity Index，EAI)表示谷蛋白乳化活性:

式中，N:稀釋倍數;C:乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度(g/mL);Φ:乳化液中油的體積分數(L/L)。

靜置10min后重新取樣測定吸光值(A10)，乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(Emulsifying Stability Index，ESI)表示:

式中，Δt=10min;ΔA=A0-A10。

2 結果與討論

2.1 米渣蛋白的組成

米渣中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相對百分含量及純度見表1。

表1 米渣蛋白的組成

米渣中蛋白質主要成分是谷蛋白，其他三種蛋白含量很低，不到 1%。由于高溫液化作用，有66.72%的蛋白質未被提取出來，但其基本組成仍是谷蛋白［9］。四種蛋白的純度均不高，主要雜質是可溶性多糖和鹽類物質。

2.2 α-淀粉酶添加量及酶解時間對蛋白質純度及提取率的影響

α-淀粉酶添加量及酶解時間對米渣谷蛋白的純度及提取率的影響見圖1。α-淀粉酶的添加可以明顯提高蛋白質的純度，α-淀粉酶添加量越大，蛋白質純度越高。當添加0.5g α-淀粉酶水解3h時，米渣谷蛋白的提取率達到90.12%。同時酶解時間越長，蛋白質的純度也越高，酶解5h(α-淀粉酶添加量為0.3g)時，蛋白質的純度高達90.89%。但α-淀粉酶添加量及酶解時間均對谷蛋白提取率影響不大，均在31%左右。

圖1 α-淀粉酶處理對蛋白質純度及提取率的影響注:A:不同酶解時間(α-淀粉酶添加量為0.3g)對蛋白質純度及提取率的影響;B:不同α-淀粉酶添加量(酶解3h)對蛋白質純度及提取率的影響。

2.3 pH對米渣谷蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

隨著pH的變化，蛋白質表面的帶電情況及溶解度隨之變化，乳化與乳化穩(wěn)定性同樣也發(fā)生變化。米渣谷蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性與pH的關系見圖2。

圖2 pH對米渣谷蛋白功能性質的影響注:A:不同pH下氮溶解指數(NSI)的變化; B:不同pH下乳化活力指數(EAI)的變化; C:不同pH下乳化穩(wěn)定性指數(ESI)的變化。

谷蛋白的溶解度在pH5.0(等電點附近)時最小，在低于或高于pH5.0時，蛋白質分別帶凈的正電荷和凈的負電荷，帶電氨基酸殘基的靜電推斥和水合作用促進了蛋白質的溶解，溶解度增加，且堿性條件下的溶解度明顯高于酸性條件下的溶解度。

通常蛋白質溶解度和乳化性或乳化穩(wěn)定性間呈正相關［15］，同樣米渣谷蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性變化趨勢與溶解性有相似之處，在pH5.0，乳化活力最小且乳化穩(wěn)定性也最低。這是因為在等電點附近，蛋白質溶解度最低，吸附在油-水界面的蛋白質減少，界面面積小;且在等電點處，蛋白質表面凈電荷為零，蛋白質的親水性降低，因而導致其乳化活力及乳化穩(wěn)定性在該點時最低;而隨著pH高于或低于5.0，蛋白質的溶解度增大，更多的蛋白質移動到油-水界面，溶液界面蛋白膜加厚，使得蛋白質的乳化性增大，同時當pH遠離等電點時，蛋白質的凈電荷增多，增加了分子間的靜電斥力，使離散雙電層加厚，避免了液滴的聚集，因此乳化穩(wěn)定性能得到提高。

2.4 鹽離子強度對米渣谷蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

鹽離子強度(以NaCl濃度表示)對米渣谷蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響見圖3。

圖3 鹽離子強度對米渣谷蛋白功能性質的影響注:A:不同NaCl濃度下氮溶解指數(NSI)的變化; B:不同NaCl濃度下乳化活力指數(EAI)的變化; C:不同NaCl濃度下乳化穩(wěn)定性指數(ESI)的變化。

由圖3可以看出，NaCl濃度在0%～2.5%范圍內，谷蛋白的溶解性和乳化性均呈現先升高后降低的趨勢，乳化穩(wěn)定性則相反。在NaCl濃度為0.5%時，溶解性和乳化性均達到最大，NSI和EAI分別為7.24%和3.25m2/g。在低鹽濃度(＜0.5%)，鹽離子濃度的升高，會增加蛋白質表面的電荷，增強蛋白質分子與水分子的作用，從而使蛋白質在水溶液的溶解度增大，相應乳化性也隨之提高。當鹽濃度大于0.5%時，鹽離子與水分子結合，降低了蛋白質的水合作用，導致蛋白質分子間的作用力增大，即降低了蛋白質溶解度，蛋白質的乳化性也隨之降低。

米渣谷蛋白的乳化穩(wěn)定性則呈現相反趨勢，在低鹽濃度(＜1.0%)時，鹽離子濃度的增加，乳化穩(wěn)定性下降，當鹽濃度大于1.0%時，乳化穩(wěn)定性隨鹽離子濃度增大而增大;表明蛋白質間的靜電作用力對乳化穩(wěn)定性的影響比蛋白質的溶解性對其的影響更大。

2.5 多糖對米渣谷蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

卡拉膠對米渣谷蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響見圖4。結果表明，隨著卡拉膠濃度增大，蛋白質的溶解性和乳化性均逐漸提高?？ɡz作為一種陰離子多糖，當蛋白質也帶凈的負電荷時，卡拉膠能與蛋白質分子片段上帶正電荷的區(qū)域發(fā)生靜電吸引，形成可溶性復合物，這種復合物可以大大提高蛋白質的乳化活性［16］。蛋白質與卡拉膠的結合，使得界面蛋白膜加厚，其乳化穩(wěn)定性大大提高。但當卡拉膠濃度達到一定程度(1.0mg/mL)，繼續(xù)增加卡拉膠，過量的未與蛋白質結合的卡拉膠會因滲透壓的差異造成乳液的排斥絮凝［17］，從而破壞蛋白質的乳化穩(wěn)定性。

圖4 多糖對米渣谷蛋白功能性質的影響

3 結論

采用α-淀粉酶對米渣谷蛋白堿提液中多糖酶解，能顯著提高蛋白質的純度，且隨著α-淀粉酶添加量的增大和酶解時間的延長，蛋白質的純度也隨之提高。分離提純的米渣谷蛋白的功能性質受食品體系本身因素的影響，其中pH、NaCl濃度和卡拉膠濃度對米渣谷蛋白的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性影響較大。堿性pH有利于谷蛋白的溶解，并提高了其乳化性能及乳化穩(wěn)定性;當溶液pH為10時，谷蛋白的NSI、EAI和ESI分別為48.94%、10.62m2/g和27.00min。低濃度鹽也能促進谷蛋白的溶解，提高其乳化性能，但不利于谷蛋白乳液的穩(wěn)定性;在0.5%的NaCl溶液中，蛋白質的溶解性和乳化性最高，分別為7.24%和3.25m2/g;而在1.0%的NaCl溶液中，乳化穩(wěn)定性最低?？ɡz能顯著改善谷蛋白的溶解性和乳化性，但過量的卡拉膠會破壞蛋白質的乳化穩(wěn)定性;當卡拉膠添加量為谷蛋白的3倍時，谷蛋白的NSI和EAI提高到74.03%和12.03m2/g，但乳化穩(wěn)定性指數卻降低至24.63min。

［1］EGGUM B O，CABRERA M I Z，et al.Protein and lysine digestibility and protein quality of cooked Filipino rice diets and milled rice in growing rats［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1993，43(2):163-170.

［2］王文高，陳正行.低過敏大米研究進展［J］.糧食與油脂，2001(5):32-33.

［3］周侃，熊華，陳升軍，等.高蛋白含量米蛋白肽制備及產品營養(yǎng)成分分析［J］.食品與生物技術學報，2009，28(1):28-31.

［4］王章存，申瑞玲，姚惠源.大米分離蛋白的酶法提取及其性質［J］.中國糧油學報，2004，19(6):4-7.

［5］王書平，劉俊華.谷氨酰胺生理功能與應用研究進展［J］.安徽農業(yè)科學，2009，37(22):10375-10377.

［6］HARDWICK J E，GLATZ C E.Enzymatic hydrolysis of corn gluten meal［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1989，37:1188-1192.

［7］JU Z Y，HETTIARACHCHY N S，RATH N.Extraction，denaturation and hydrophobic properties of rice flour proteins［J］. Food Chemistry and Toxicology，2001，66(2):229-232.

［8］AGBOOLA S，NG D，MILLS D.Characterisation and functional properties of Australian rice protein isolates［J］.Journal of Cereal Science，2005，41:283-290.

［9］王章存.米渣蛋白的制備及其酶法改性研究［D］.無錫:江南大學，2005.

［10］馬海樂，辛志宏，吳守一.采用堿提酸沉與淀粉酶解復合法制備小麥胚芽蛋白的試驗研究［J］.農業(yè)工程學報，2004，20 (6):178-180.

［11］劉驥，姚惠源，陳正行.利用米渣為原料制備大米濃縮蛋白［J］.食品工業(yè)，2004(3):11-13.

［12］黃河龍，杜風光，蘇鋒.米糟制備大米蛋白研究［J］.糧食與油脂，2008(2):23-25.

［13］王文平.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量［J］.食品研究與開發(fā)，2008(1):115-117.

［14］C Juan，Y L Xiong，R Suarez.Rheological properties of mixed muscle/nonmuscle protein emulsions treated with transglutaminase at two ionic strengths［J］.International Journal of Food Science and Technology，2003，38:777-785.

［15］管斌，林洪，王廣策.食品蛋白質化學［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005.

［16］DIEKINSON E.Emulsion stabilization by Polysaccharides and Protein-Polysaccharide complexes.In:Food Polysaccharides and Their Applications［M］.U.S.A.:Alistair M Stephen edited，Marcel Dekker，1995:501-515.

［17］DIEKINSON E.Stability and rheological implications of electrostatic milk Protein-Polysaccharide interactions［J］.Trends in Food Science＆Teehnology，1998(9):347-354.

Purification and functional properties of rice dregs glutelin

SHI Su-hua，DENG Bo，XIONG Hua*，DU Yan-xue，BAI Chun-qing，ZHAO Li-ping
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

Protein of the rice dregs was fractionated into albumin，globulin，prolamin，and glutelin according to Osborne method.The glutelin was then purified by α-amylase，and protein content could reach more than 90%.The functional properties of glutelin were investigated under the variable ranges of pH value，NaCl and carrageenan concentrations.The results suggested that purified glutelin exhibited better solubility，emulsifying and emulsion stabilities when the pH was away from the isoelectric point.The solubility and emulsifying abilities of glutelin increased with the increasing concentration of NaCl(from 0 to 0.5%).As the NaCl amount increased to 1.0%， glutelin possessed the mininum emulsion stability.Additionally，carrageenan could significantly improve the emulsion stability of the glutelin，while the excess carrageenan would decrease emulsion stability of glutelin.

rice dregs;glutelin;α-amylase;solubility;emulsifying property;emulsion stability

TS210.1

A

1002-0306(2011)09-0090-04

隨著“瘋牛病”、“口蹄疫”等疫情在全世界的蔓延，動物蛋白的安全性已遭到質疑，植物蛋白的開發(fā)利用越來越受到重視。大米蛋白作為植物蛋白，氨基酸配比平衡合理，具有高生物效價［1］和低過敏性［2］等特點。大米經過高溫液化和糖化作用后，蛋白濃縮富集，形成大米濃縮蛋白，俗稱米渣。米渣中蛋白質含量55%以上［3］，其中75%～90%是谷蛋白。米谷蛋白中含大量酰胺基氨基酸，其谷胺酰胺含量達18.29%［4］。谷氨酰胺可以為機體提供必需的氮源，促使肌細胞內蛋白質合成，提高機體的抗氧化能力和機體免疫力，谷氨酰胺在維持小腸代謝、結構和功能上也起重要的作用［5-6］，因此，谷蛋白可以作為一種營養(yǎng)補充劑添加到食品中。目前，谷蛋白的提取多采用Osborne方法［7-8］。但米渣不同于大米，由于高溫液化作用，蛋白質和多糖物質緊密結合在一起［9］，在堿提過程中，有部分多糖和蛋白質一起溶出;同時，在酸沉淀時也有部分多糖和蛋白質一起沉淀，從而影響了蛋白質的純度［10］。劉驥采用堿法提取米渣蛋白，純度低于80%［11］，黃河龍以米糟為原料堿提的蛋白純度也僅有73.2%［12］。因此本實驗采用α-淀粉酶法純化米渣谷蛋白，在堿提之后，加入α-淀粉酶法水解提取液中的多糖，從而提高蛋白質的純度，并研究了食品體系中常見的三種因素(pH、鹽離子和多糖)對米渣谷蛋白功能性質(溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性)的影響，為其在食品中的應用提供理論指導。

2010-10-08 *通訊聯系人

史蘇華(1986-)，男，碩士，研究方向:糧食、油脂與植物蛋白工程。

國家發(fā)改委項目(發(fā)改投資［2009］2825號);南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200809);南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題(SKLF-TS-200818)。