慶大霉素發(fā)酵工藝的研究

陳梁軍

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350002）

慶大霉素發(fā)酵工藝的研究

陳梁軍

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350002）

目的通過(guò)對(duì)慶大霉素發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高發(fā)酵生產(chǎn)的能力。方法以絳紅色小單孢菌2-25為對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)和四因素三水平（4×3）正交試驗(yàn)篩選出了菌株2-25的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。結(jié)果該菌種的最佳發(fā)酵條件：5.0%玉米淀粉，3.0%黃豆餅粉，0.6%蛋白胨，0.15%硝酸鉀，在33℃、pH 7.8、接種量25%，培養(yǎng)84h，產(chǎn)品質(zhì)量符合中國(guó)藥典2005版（CP2005）、美國(guó)藥典28（USP28）。結(jié)論優(yōu)化發(fā)酵條件后菌株2-25發(fā)酵水平明顯提高。

慶大霉素；絳紅色小單孢菌；發(fā)酵；正交試驗(yàn)

慶大霉素（Gentamicin）是由絳紅色小單孢菌（Micromonmspora purpurea）產(chǎn)生的氨基糖苷類(lèi)抗生素，對(duì)革蘭陽(yáng)性、革蘭陰性菌特別是對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌有良好的抗菌效能，臨床肌內(nèi)（靜脈）注射后吸收迅速、完全，故被廣泛應(yīng)用于消炎退熱；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)口服給藥在體內(nèi)難以吸收，在腸道中保持較高濃度，確保其殺菌效果，又被臨床用于胃腸道和呼吸道感染。后又發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)飼料的利用率，在禽畜體內(nèi)不留殘毒或低殘毒[1]，于是又被廣泛用于畜牧業(yè)，生產(chǎn)“綠色食品”。

我國(guó)生產(chǎn)的慶大霉素大部分出口。但由于小單孢菌產(chǎn)素率低，發(fā)酵用料多，周期長(zhǎng)，因此生產(chǎn)成本高。為了提高我國(guó)在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，改進(jìn)慶大霉素的生產(chǎn)方法已勢(shì)在必行。慶大霉素自1963年問(wèn)世以來(lái)，生產(chǎn)徘徊在一定范圍水平，且生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)外均在120～140h。慶大霉素生產(chǎn)水平低的原因主要有：①菌種代謝合成能力有限；②孢子發(fā)芽率很低，新鮮培養(yǎng)的菌種發(fā)芽率僅有15%～20%；③代謝合成過(guò)程要求溶氧很高等，一般很難滿足[2]。根據(jù)絳紅色小單孢菌合成氨基糖苷類(lèi)抗生素和合成抗生素過(guò)程中初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的關(guān)系，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)改變培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件，通過(guò)搖瓶小試，30L發(fā)酵中試的基礎(chǔ)上，在100m3發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，取得突破性進(jìn)展。發(fā)酵周期較原工藝縮短約35%，發(fā)酵指數(shù)提高約43%，產(chǎn)品質(zhì)量符合中國(guó)藥典2005版（CP2005）、美國(guó)藥典28版（USP28）。

1 材料與方法

1.1 菌種

絳紅色小單孢菌2-25由福建省福抗藥業(yè)股份有限公司保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板分離培養(yǎng)基（%）： 麩皮1.5%、瓊脂2.0%、碳酸鈣0.05%、天門(mén)冬酰胺0.01%，磷酸二氫鉀0.03%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.05%、硝酸鉀0.2%和玉米淀粉1.0%，消前pH 6.3～6.5。

一級(jí)種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.2%、玉米淀粉1.2%、玉米粉2.0%、蛋白胨0.3%、黃豆餅粉1.2%、碳酸鈣0.7%、氯化鈷0.002%、硝酸鉀0.1%，消前pH 7.5～7.6。

二級(jí)種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.3%、玉米淀粉2.0%、玉米粉0.5%、蛋白胨0.4%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.7%、氯化鈷0.001%，硫酸銨0.1%、硝酸鉀0.1%，淀粉酶0.01 %和泡敵0.02%，消前pH 7.5～7.6。

酵培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.5%、玉米淀粉5.0%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.6%、黃豆餅粉3.0%、碳酸鈣0.7%、氯化鈷0.001%、硫酸銨0.1%、硝酸鉀0.15%、淀粉酶0.02%和泡敵0.03%， 消前pH 7.5～7.6。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面及平板培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，相對(duì)濕度45～65%，培養(yǎng)4～5d。

種子培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度34℃，相對(duì)濕度45～65%，搖瓶裝量30mL/250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速320r/min，培養(yǎng)48h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，相對(duì)濕度45%～65%，搖瓶裝量30mL/250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速320r/min，接種量25%，培養(yǎng)4d。

30L小試發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，通氣1∶1.5（vvm），罐壓0.02Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，接種量25%，培養(yǎng)4d。

100m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，通氣1∶1.2（vvm），罐壓0.02Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量25%，培養(yǎng)4d。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 初始pH值對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

在30L發(fā)酵罐中采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液初始pH分別調(diào)至6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4。搖瓶發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液生物效價(jià)。為排除pH干擾。將終發(fā)酵液pH全部調(diào)至7.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)基和最適pH下，分別選取了27℃、30℃、33℃、36℃、39℃作為菌株的發(fā)酵培養(yǎng)溫度，搖瓶發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)方法同上，測(cè)發(fā)酵液生物效價(jià)。

1.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)基和最適pH及最佳溫度下，搖瓶培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法同上，每12h取發(fā)酵液測(cè)定生物效價(jià)。

1.5 分析方法

1.5.1 總糖和還原糖的測(cè)定

斐林試劑法[3]。

1.5.2 氨基氮的測(cè)定

甲醛法[3]。

1.5.3 生物效價(jià)的測(cè)定

按照中國(guó)藥典2005版（CP2005），抗生素微生物檢定法（附錄XIA），質(zhì)量檢測(cè)按照中國(guó)藥典2005版規(guī)定。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將玉米淀粉、蛋白胨、黃豆餅粉和硝酸鉀四個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平選擇無(wú)交叉作用的正交表L9（34）[4]，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié) 果

2.1 初始pH對(duì)產(chǎn)抑茵活性物質(zhì)的影響

分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液生物效價(jià)。結(jié)果顯示該菌株在pH 6.9～8.4均有抑菌物質(zhì)產(chǎn)生。在pH 7.8時(shí)達(dá)到最大值，pH超過(guò)7.8產(chǎn)抑菌物質(zhì)量下降。

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)抑茵活性物質(zhì)的影響

以初始pH 7.8的培養(yǎng)基接種2-25菌懸液，分別置于27℃、30℃、33℃、36℃、39℃搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果在33℃左右，2-25菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)量最高。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)抑茵活性物質(zhì)的影響

以初始pH 7.8的培養(yǎng)基接種2-25菌懸液，分別置于33℃搖瓶培養(yǎng)，每隔12h測(cè)定生物效價(jià)，結(jié)果顯示發(fā)酵生物效價(jià)隨著培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，84h后，生物效價(jià)不再增加，說(shuō)明2-25菌株在培養(yǎng)到84h時(shí)生物效價(jià)達(dá)最高峰。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

以玉米淀粉，蛋白胨，黃豆餅粉，硝酸鉀四個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表中極差可見(jiàn) RC＞RB＞RD＞RA。即4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵影響的強(qiáng)度依次為黃豆餅粉、蛋白胨、硝酸鉀、玉米淀粉。其最佳配比為A1B2C1D3。由試驗(yàn)得出菌株2-25的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為黃豆餅粉3.0%，蛋白胨0.6%，硝酸鉀0.15%，，玉米淀粉5.0%。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

應(yīng)用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在100m3發(fā)酵罐連續(xù)生產(chǎn)60批，發(fā)酵周期為84h較原工藝縮短約35%，發(fā)酵指數(shù)為1.3839較原工藝提高約43%，產(chǎn)品按照中國(guó)藥典2005版（CP2005）進(jìn)行組分檢測(cè)：C1為27.8%，C1a為29.7%，C2a+C2為42.5%，符合CP2005標(biāo)準(zhǔn)（C1應(yīng)為25%～50%，C1a應(yīng)為15%～40%，C2a+C2應(yīng)為20%～50%），也符合美國(guó)藥典28版（USP28）。

3 討 論

用正交試驗(yàn)優(yōu)選得到的發(fā)酵培養(yǎng)基達(dá)到提高發(fā)酵水平的目的，發(fā)酵周期較原工藝縮短約35%，發(fā)酵指數(shù)提高約43%，產(chǎn)品質(zhì)量符合中國(guó)藥典2005版（CP2005）、美國(guó)藥典28（USP28）。本試驗(yàn)就慶大霉素發(fā)酵工藝條件和培養(yǎng)基配方進(jìn)行了初步的篩選，對(duì)其高產(chǎn)菌種選育工作有待進(jìn)一步研究。

[1]沈川,肖希龍.新霉素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留及其測(cè)定方法[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1998,32(2):53-56.

[2]管玉霞,劉樹(shù)滔.幾種氨基酸在慶大霉素生產(chǎn)中的作用[J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(12):95-100.

[3]Chen JM,Xu LD.Antibiotic industry analysis [M].Beijing:Chinese Medical Technology Publishing House,1991:109.

[4]夏志蘭,喻桃生,周連玉等.靈芝液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)雜志,2007,27(2):10-15.

Research of Fermentation Technology for Production of Gentamicin

CHEN Liang-jun
(Fujian Biological Engineering Vocational and Technical College, Fuzhou350002, China)

ObjectiveImprove fermentation production ability by optimization of the Gentamicin fermentation condition.MethodsThe optimum fermentation medium and culture condition of Gentamicin 2-25 was obtained by using one-factor experimental design and Four factor three level orthogonal experimental design.ResultsThe optimum fermentation formulation: 5.0% corn starch，3.0% soybean powder，0.6% peptone，0.15% potassium nitrate.It was cultured at 33℃ and pH 7.8 for 84h with 25% of inoculation numbers.The product quality conformed to China Pharmacopoeia 2005 (CP2005) and the United States Pharmacopoeia 28 (USP28).ConclusionAfter optimization，the fermentation level of strains 2-25 was greatly improved.

Gentamicin; Micromonmspora purpurea; Fermentation; Orthogonal experiments

R978.1+2

B

1671-8194（2011）33-0247-03