高效液相色譜法測定南、北五味子中4種木脂素含量

陰冠秀，杜 冰,*，魯旺旺，華洋林，唐 建，楊公明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510665)

高效液相色譜法測定南、北五味子中4種木脂素含量

陰冠秀1，杜 冰1,*，魯旺旺1，華洋林2，唐 建2，楊公明1

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510665)

目的：采用高效液相色譜法同時測定17種不同產(chǎn)地的五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素含量。方法：采用Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)柱，甲醇-水(73:27，V/V)作流動相，流速1.0mL/min，檢測波長254nm。結(jié)果：五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素含量測定方法的線性關系良好，線性范圍為0.01～0.08mg/mL，相關系數(shù)R2＞0.9990；RSD分別為0.86%、0.37%、0.19%和0.15%。結(jié)論：該方法精密度、重現(xiàn)性和分離效果好，分析快速準確，適合于該藥材中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素含量的測定；不同產(chǎn)地的4種木脂素成分均存在一定的差別，北五味子中五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素的含量稍高，而五味子甲素含量卻稍低，南五味子恰與之相反。

南五味子；北五味子；高效液相色譜；木脂素

五味子是著名的滋補性中藥，因產(chǎn)地不同，有南、北五味子之分，分別為木蘭科植物華中五味子(Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.)和五味子(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.)的干燥成熟果實，都具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[1-2]。

五味子中含有的聯(lián)苯環(huán)辛二烯結(jié)構的木脂素類物質(zhì)是其主要的生物活性成分，主要包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等[3]，此類物質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，還具有抗艾滋病毒、抑菌、抗腫瘤和PAF拮抗等多種活性[4-12]，并且其對清除自由基也有一定的效果等[13-14]。

本實驗以南、北五味子中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素作為研究對象，利用高效液相色譜法，對17個產(chǎn)地的南、北五味子中的4種木脂素進行色譜分離和含量測定。該方法簡單、快速、準確，可為南北五味子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

8個南五味子樣品來源于云南、四川、湖北Ⅰ、湖北Ⅱ(湖北神農(nóng)架)、安徽、河南、陜西、廣西；9種北五味子來源于吉林長白山、遼寧鞍山、遼寧本溪、遼寧撫順、黑龍江、內(nèi)蒙古、遼寧Ⅰ、遼寧Ⅱ、遼寧Ⅲ。

五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對照品(批號分別為110857-200709、110764-200609、110765-200710)中國藥品生物制品鑒定所；五味子醇乙 四川維克奇生物科技有限公司；甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；自制超純水；其余試劑均為分析純。

LC-10AT型高效液相色譜儀、SPD-10Avp紫外檢測器 日本島津公司；四兩裝高速中藥粉碎機 瑞安市環(huán)球藥械廠；電子精密天平、pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；SH2-88臺式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 原料預處理

將不同產(chǎn)地的五味子干果烘干后，除雜、粉碎成粉后備用。

1.3 色譜條件的選擇

采用Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，檢測波長為254nm，柱溫為室溫，進樣體積20μL，流速為1.0mL/min。分別考察不同比例的甲醇-水作為流動相時對分離效果的影響[15-16]。

1.4 樣品處理

精密稱取不同產(chǎn)地五味子粉末(40目)0.5g，置于50mL錐形瓶中，加甲醇約45mL超聲提取(功率280W，頻率40kHz)20min，放冷，搖勻，過濾后加甲醇于50mL容量瓶定容，精密吸取供試品20μL進行液相測定。

1.5 標準溶液的配制

精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素對照品各10mg，分別加甲醇溶解于50mL容量瓶中定容，搖勻，使之成為質(zhì)量濃度為0.20mg/mL的混合標準品溶液。分別精密吸取一定體積上述混標溶液到10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按照1.3節(jié)中確定的色譜條件，進行液相色譜分析，繪制標準曲線。

1.6 方法學考察

分別對所建立測定方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度、回收率進行評價。

1.7 樣品測定

按1.4節(jié)樣品處理方法對17個不同產(chǎn)地的五味子進行處理，進行液相色譜分析，進樣量20μL，采用外標法定量，測定不同產(chǎn)地五味子中4種木脂素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

圖1 4種木脂素對照品掃描圖Fig.1 HPLC chromatogram of four lignin standards

圖2 南五味子(云南)色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Schisandra sphenanthera (Yunnan)

圖3 北五味子(吉林長白山)色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Schisandra chinensis (Changbai Mountain, Jilin)

實驗結(jié)果表明：當選用甲醇-水(73:27，V/V)作流動相時，可以使待測定的4種木脂素與其相鄰的物質(zhì)得到較好的分離，各木脂素的對照品色譜圖如圖1所示，南五味子和北五味子樣品色譜圖分別如圖2、3所示。

由圖1～3可以看出，各對照品和樣品的出峰時間基本一致，而且樣品中待測的四種木脂素均與其相鄰物質(zhì)能夠較好的分離。因此確定其流動相為甲醇-水(73:27，V/V)。

2.2 線性范圍的考察

分別量取上述不同濃度的混合對照品溶液各20 μ L進行液相測定，以各木脂素相應的峰面積為縱坐標，各木脂素的質(zhì)量濃度為橫坐標，得到各木脂素質(zhì)量濃度-峰面積線性回歸方程如下：

以上結(jié)果表明混合對照品溶液在0.01～0.08mg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液分別在0、3、6、9、12h進樣20μL測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味乙素的峰面積，相對標準偏差(RSD)依次為1.42%、1.07%、1.45%和1.99%。表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性實驗

精密稱取5份遼寧Ⅰ的五味子粉樣品，樣品按照1.4節(jié)方法處理，進樣分析，分別測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味乙素的峰面積，相對標準偏差(RSD)依次為1.04%、1.60%、1.31%和1.53%。該結(jié)果表明方法重現(xiàn)性好。

2.5 精密度實驗

取同一供試品溶液，按照2.1節(jié)色譜條件重復進樣5次，測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味乙素的峰面積，相對標準偏差(RSD)依次為0.86%、0.37%、0.19%和0.15%。表明該方法精密度很高。

2.6 回收率實驗

精密稱取5份已知上述4種木脂素含量的五味子粉末約0.5g，分別精密加入混合標準品溶液5mL，按照1.4節(jié)樣品處理方法制備供試品溶液，按照2.1節(jié)色譜條件進樣分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，本法測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素的平均回收率分別為97.64%、97.91%、98.50%和99.02%，RSD依次為0.7155%、1.020%、0.4678%和0.4074%。由此可知，該方法的回收率較高，偏差較小，準確度較高。

表1 回收率實驗結(jié)果Table 1 Average recovery rate for four kinds of lignin in 5 samples

2.7 不同產(chǎn)地五味子中4種木脂素含量的測定

精密吸取五味子種子樣品溶液20μL，按前述色譜條件進樣分析，測定色譜峰面積，用外標法計算，測定結(jié)果見表2。

由表2可以看出，北五味子中五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素的含量稍高，而五味子甲素含量卻稍低，南五味子恰與之相反。同時可以看出，南五味子中這四種木脂素的總量都較低，最大的是產(chǎn)地四川的五味子達到1.067%；而北五味子中這四種木脂素的總量在1.274%～2.272%之間，該結(jié)果與文獻[17-20]的結(jié)論較一致。

2.8 不同產(chǎn)地的五味子外觀比較

通過對實驗中的南五味子樣品與北五味子樣品外形進行觀察可知，南五味子的果實肉薄、粒小、干燥無油性、無光澤、整體品相較差，而北五味子的果實肉厚、粒大飽滿、有油性、光澤好。

3 結(jié) 論

本實驗采用高效液相色譜法，建立了測定南、北五味子中4種木脂素(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素及五味子乙素)的分析方法。分別對17個不同產(chǎn)地的南、北五味子樣本進行色譜分析。結(jié)果表明，樣品中各組分的色譜峰基本達到了基線分離。該方法重復性好、靈敏度高，可用于對五味子中上述4種木脂素的定性與定量。同時本實驗結(jié)果可以為各地的五味子區(qū)域化種植提供參考。

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Determination of Lignins in Schisandra sphenanthera and Schisandra chinensis by High Performance Liquid Chromatography

YIN Guan-xiu1，DU Bing1,*，LU Wang-wang1，HUA Yang-lin2，TANG Jian2，YANG Gong-ming1
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；
2. Infinitus (China) Co. Ltd., Guangzhou 510665, China)

Objective: To establish a HPLC method for the determination of schisandrin, schisandrol B, deoxyschizandrin and schisandrin B in Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils. and Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. from 17 growth areas. Methods:The chromatographic separation was carried out on Diamonsil C18 (250 mm× 4.6 mm, 5 μm) column using methanol-water (73:27, V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was 250 nm. Results: A good linear relationship was achieved with a correlation coefficient in the range of 0.01 to 0.08 mg/mL (R2= 0.9990) and a RSD of 0.86%, 0.37%,0.19% and 0.15%, respectively. Conclusion: The developed HPLC method reveals a good separation efficiency, reproducibility and accuracy. This method can be used for determining schisandrin, schisandrol B, deoxyschizandrin and schisandrin B in herbs.Higher amounts of schisandrin, schisandrol B and schisandrin B are present in Schisandra chinensis than in Schisandra sphenanthera.

Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.；Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.；high performance liquid chromatography (HPLC)；lignin

R284.1

A

1002-6630(2011)10-0218-04

2010-07-26

陰冠秀(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：yin.gx@163.com

*通信作者：杜冰(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：gzdubing@163.com