不同氧分壓條件下金針菇貯藏保鮮相關(guān)酶活性的研究

王成濤，王昌濤，趙 磊，劉 柳，朱欣娜，孫寶國(guó)*

(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

不同氧分壓條件下金針菇貯藏保鮮相關(guān)酶活性的研究

王成濤，王昌濤，趙 磊，劉 柳，朱欣娜，孫寶國(guó)*

(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

研究不同氧分壓條件下金針菇貯藏過(guò)程中抗氧化相關(guān)酶活性的變化及其對(duì)保鮮效果的影響。在聚乙烯塑料袋中放入金針菇100g、膨潤(rùn)土吸濕劑8g、活性炭6g，分別按0、20%、50%、70%、80%、90%、100%氧氣分壓充氣包裝，于1～3℃冷藏，每隔5～7d取樣檢測(cè)。結(jié)果顯示：80%氧氣分壓試驗(yàn)組的保鮮效果最好；在貯藏的最初2周，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、脂氧合酶(LOX)等與抗氧化、清除自由基相關(guān)的酶活性明顯升高，多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、纖維素酶(CMCase)等酶活性降低；貯藏2周后SOD、CAT、LOX等酶活性明顯減弱，POD、PPO等酶活力明顯增強(qiáng)。表明SOD、CAT、LOX等抗氧化酶活性的減弱，導(dǎo)致菇體內(nèi)O2－·、·OH、過(guò)氧化物等逐漸積累，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞內(nèi)容物外滲增多；纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁降解，導(dǎo)致組織軟化出水，酶促褐變活力增強(qiáng)，是致使金針菇衰老、加速變質(zhì)、品質(zhì)降低的重要原因。

金針菇；高氧氣調(diào)包裝；保鮮；抗氧化酶系統(tǒng)；衰老

以低O2高CO2為特征的氣調(diào)貯藏(modified atmosphere packaging，MAP)已廣泛應(yīng)用于果蔬的保鮮，但這種方法存在一定缺陷[1-2]，在低氧環(huán)境中果蔬進(jìn)行無(wú)氧酵解，積累乙醛、乙醇等異味物質(zhì)，對(duì)果蔬產(chǎn)生毒害。高O2氣調(diào)包裝(high oxygen atmospheres packaging，HOAP)保鮮技術(shù)是延長(zhǎng)食品貯藏期的另一個(gè)選擇[3-6]。新鮮食用菌在低溫貯藏過(guò)程中，由于其呼吸和代謝作用，還原糖、蛋白質(zhì)等發(fā)生降解與轉(zhuǎn)化；在貯藏初期，菇體內(nèi)氧化-還原反應(yīng)是平衡的，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其平衡遭到破壞，與膜質(zhì)過(guò)氧化作用、自由基清除相關(guān)的抗氧化酶活性發(fā)生變化，菇體呈現(xiàn)一逐漸衰老的過(guò)程，伴隨其色、味、形發(fā)生明顯的變化，這些都對(duì)于菇體的貯藏保鮮和貨架期產(chǎn)生重要影響[7]。本實(shí)驗(yàn)選取超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、纖維素酶(cellulose，CMCase)等貯藏保鮮相關(guān)酶，研究不同氧分壓條件下金針菇低溫貯藏過(guò)程中酶活性的變化，探討其抗氧化與衰老相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮金針菇，產(chǎn)于北京郊區(qū)菇場(chǎng)。

鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、亞油酸、聚乙烯吡咯烷酮、NBT、羧甲基纖維素鈉、30%過(guò)氧化氫、甲硫氨酸、亞硫酸氫鈉等(分析純) 北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯真空食品包裝袋(20cm×30cm) 北京市迪隆天雅包裝機(jī)械有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22G型高速冷凍離心機(jī) 日本日立株式會(huì)社；722E型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FS-300型塑料封口機(jī) 北京市迪隆天雅包裝機(jī)械有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

采收后的金針菇在冷庫(kù)中預(yù)冷20～24h后。在真空食品包裝袋中放入100g金針菇、8g膨潤(rùn)土吸濕劑、6g活性炭，向袋內(nèi)充入不同比例的氧氣和氮?dú)獾幕旌蜌?、密封，使袋?nèi)氧氣含量分別為0、20%、50%、70%、80%、90%、100% (N2調(diào)節(jié)混和氣組成)，封口包裝后，放入1～3℃冷庫(kù)貯藏，每隔5～7d抽樣評(píng)定與檢測(cè)1次，檢測(cè)其衰老相關(guān)酶活性。

1.4 衰老相關(guān)酶活性測(cè)定

1.4.1 多酚氧化酶(PPO)活性

取新鮮金針菇，切碎混勻，稱取2.0g置于預(yù)冷研缽中，加少許石英砂，加入2.0mL預(yù)冷的0.05moL/L pH5.7磷酸緩沖液(PBS)，冰浴研磨勻漿，再用5.0mL PBS分3次沖洗研缽及玻璃棒，轉(zhuǎn)移到10mL離心管中，10000r/min離心10min(4℃)，上清液為粗酶液，鄰苯二酚比色法測(cè)定其PPO活力[8]。410nm測(cè)定波長(zhǎng)條件下，吸光度每分鐘增加0.01定義為一個(gè)PPO活性單位(U)。

1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性

粗酶液的制備參照PPO描述方法，但使用含1%聚乙烯吡咯烷酮的0.05moL/L pH7.8 PBS緩沖液。取20μmol/L 核黃素、130mmol/L甲硫氨酸、750μmol/L NBT、100μmol/L EDTA各0.5mL，混勻后加入粗酶液，強(qiáng)光下照射20min，560nm測(cè)定其吸光度。將NBT的光化學(xué)反應(yīng)抑制到對(duì)照所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)[9]。

1.4.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性

CAT粗酶液的制備參照PPO描述方法，但使用pH7.8 PBS緩沖液。過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定采用紫外吸收法[10]。每分鐘吸光度(240nm)下降0.01的酶量定義為1個(gè)CAT活性單位(U)。

1.4.4 過(guò)氧化物酶(POD)活性

POD活性測(cè)定參照陳建勛的方法[11]。每分鐘吸光度變化0.01定義為1個(gè)POD活性單位(U)。

1.4.5 纖維素酶(CMCase)活性

參照陳學(xué)紅的方法[11]。1min水解生成1μg 葡萄糖的酶量定義為1個(gè)羧甲基纖維素酶(CMCase) 活力單位(U)[12]。

1.4.6 脂氧合酶(LOX)活性

底物溶液的制備與LOX活性測(cè)定參照鐘芳等[13]的方法。每分鐘吸光度變化0.01定義為1個(gè)LOX活力單位(U)。

1.5 感官指標(biāo)評(píng)定

參照肖功年等[14]方法稍作修改，由10人經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員組成感官評(píng)定小組，根據(jù)金針菇的色澤、形態(tài)、氣味和表面冷凝水打分評(píng)定，計(jì)算其總分和平均值。滿分10分，其中形態(tài)與氣味各占3分，色澤與冷凝水各占2分。

表1 感官品質(zhì)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of golden needle mushroom

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)定

圖1、2顯示，貯藏過(guò)程中金針菇感官品質(zhì)逐漸下降，尤其是在貯藏的后期，品質(zhì)下降迅速；20%～50%低氧分壓試驗(yàn)組和90%～100%高氧分壓試驗(yàn)組，貯藏至30d后，菌蓋和根部呈棕褐色，菇體發(fā)黏，顏色較深；70%～80%高氧分壓的金針菇的感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)較高，說(shuō)明其貯藏保鮮效果更好。

圖1 金針菇貯藏過(guò)程中感官評(píng)定得分的變化Fig.1 Sensory evaluation of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

圖2 不同氧分壓條件下金針菇貯藏35d時(shí)的形態(tài)圖片F(xiàn)ig.2 Appearance of golden needle mushroom on 35 days of modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

2.2 多酚氧化酶(PPO)活力

PPO是一類含Cu2+的蛋白質(zhì)，具有基團(tuán)專一性，能催化酚類物質(zhì)氧化成醌和水，醌再經(jīng)非酶促聚合，形成褐色物質(zhì)，產(chǎn)生褐變。PPO是食用菌發(fā)生褐變的主導(dǎo)酶，無(wú)論在生理代謝還是加工中，多酚類物質(zhì)的氧化變化都起著重要作用[8]。金針菇貯藏過(guò)程中菌褶、菌蓋頂部、菇腿等部位易發(fā)生褐變，褐變不僅影響產(chǎn)品的外觀、風(fēng)味，而且還影響營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

圖3 金針菇貯藏過(guò)程中PPO活力的變化Fig.3 PPO activities of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

由圖3可以看出，整個(gè)貯藏過(guò)程中PPO活力逐漸增長(zhǎng)，前期相對(duì)比較平緩，中后期逐漸增強(qiáng)，造成菇體顏色逐漸變深，褐變程度更加明顯；高氧分壓有利于抑制PPO活力，抑制酶促褐變的發(fā)生，尤其以80% 氧分壓試驗(yàn)組，其PPO活力相對(duì)較低，這有助于減緩金針菇發(fā)生褐變。

2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活力

SOD是一類含不同金屬離子的氧化還原酶。SOD可清除組織中活性氧，維持活性氧代謝平衡，防止細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2－·)毒害作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和正常生理功能，因而SOD能保護(hù)細(xì)胞，延緩果蔬衰老，是果蔬保護(hù)酶系統(tǒng)中活性氧清除能力的重要指標(biāo)[9]。

圖4 金針菇貯藏過(guò)程中SOD活力的變化Fig.4 SOD activities of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

圖4 結(jié)果顯示，在金針菇貯藏前期SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，SOD酶活力明顯下降。其中在貯藏前期(14d之前)，以20%～50%氧分壓的金針菇的SOD活性上升的更快，這在保護(hù)細(xì)胞，延緩衰老上發(fā)揮重要作用；在貯藏中后期(14d后)，不同氧分壓試驗(yàn)組SOD酶活力均下降，但各試驗(yàn)組SOD酶活性差別不明顯。金針菇貯藏過(guò)程中SOD酶活力的下降，導(dǎo)致超氧陰離子自由基(O2－·)對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)毒害作用的加強(qiáng)，是致使金針菇后期加速變質(zhì)的重要原因之一。2.4 過(guò)氧化氫酶(CAT)活力

圖5 金針菇貯藏過(guò)程中CAT活力的變化Fig.5 CAT activities of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

CAT廣泛存在于食用菌和動(dòng)植物組織中，是一類還原酶，能專一性地將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的H2O2催化分解，降低H2O2產(chǎn)生的羥自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，維持體內(nèi)正常的活性氧水平，是菇體中重要的保護(hù)酶[10]。在新鮮金針菇貯藏過(guò)程中CAT酶活力呈現(xiàn)先逐漸增加，然后逐漸減弱的趨勢(shì)(圖5)，其中80%氧分壓試驗(yàn)組的CAT酶活力，在金針菇貯藏過(guò)程中都基本高于其他試驗(yàn)組。

2.5 過(guò)氧化物酶(POD)活力

POD活性是果蔬成熟的主要標(biāo)志，該酶活性與果實(shí)呼吸作用、乙烯生物合成以及衰老細(xì)胞活性有關(guān)[11]。POD主要催化過(guò)氧化反應(yīng)，H2O2是POD反應(yīng)的主要底物，低質(zhì)量濃度(小于10mg/L) H2O2可提高POD活性，而高濃度H2O2又抑制POD活性，因此POD能夠催化組織中低濃度的H2O2氧化其他底物，以清除過(guò)氧化物和H2O2，降低H2O2對(duì)機(jī)體的侵害作用。

在金針菇貯藏過(guò)程中，不同氧分壓試驗(yàn)組的POD活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律(圖6)，高氧分壓(80%～100%)試驗(yàn)組，貯藏的30d內(nèi)POD活性變化不大，且活性較低；低氧分壓(0～50%)試驗(yàn)組基本呈現(xiàn)波浪式的起伏變化，即先增加，后逐漸下降，14d后有明顯升高，分析其原因，前期POD活性的迅速增長(zhǎng)可能是由于在貯藏期間乙烯積累，進(jìn)而影響POD的活性，先增高后下降的趨勢(shì)可能是其一種抗氧化防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制[11]。

圖6 金針菇貯藏過(guò)程中POD活力的變化Fig.6 POD activities of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

2.6 脂氧合酶(LOX)活力

LOX是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，屬于還原性酶，廣泛存在于食用菌和植物組織中[13]，但在高等植物當(dāng)中，LOX的底物只要亞油酸和亞麻酸。LOX的穩(wěn)定性弱于POD，會(huì)隨著溫度的變化而迅速失活。其生成的氫過(guò)氧化物具有高度的反應(yīng)力，能作用于機(jī)體的各種不同組分。

圖7所示，脂氧合酶的活性在貯藏的前7d左右呈現(xiàn)對(duì)數(shù)性增長(zhǎng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降；80%氧分壓時(shí)，在整個(gè)貯藏過(guò)程中LOX活性明顯高于其他試驗(yàn)組，而20%～50%低氧分壓時(shí)，LOX活性較低，且下降速度更為明顯。

圖7 金針菇貯藏過(guò)程中LOX酶活力變化Fig.7 LOX activities of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

2.7 纖維素酶(CMCase)活力

CMCase是一類糖苷水解酶，是一個(gè)多酶組分的復(fù)雜酶系，主要包括葡聚糖內(nèi)切酶(EC3.2.1.4)、葡聚糖內(nèi)切酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)等。食用菌的細(xì)胞壁是由初生壁、次生壁等組成，而纖維素、半纖維素等形成其構(gòu)架[15]。纖維素酶可加速細(xì)胞壁纖維素的降解，導(dǎo)致組織軟化出水，微生物的生長(zhǎng)繁殖加速引起腐敗變質(zhì)，直接影響其保鮮品質(zhì)。

金針菇貯藏過(guò)程中CMCase的變化趨勢(shì)如圖8所示，CMCase活性前期呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)，21d后逐漸下降的趨勢(shì)。氧分壓為0和80%時(shí)，CMCase的活性明顯低于其他試驗(yàn)組。這一結(jié)果與80%氧分壓條件時(shí)金針菇保鮮效果最好的結(jié)果直接相關(guān)，其原因可能是80%氧分壓條件時(shí)，纖維素酶活力較低，進(jìn)而減弱了細(xì)胞壁的降解與破壞，提高了保鮮效果。

圖8 金針菇貯藏過(guò)程中CMCase活力的變化Fig.8 CMCase activities of golden needle mushroom during modified atmosphere storage under varying oxygen content conditions

綜上所述，超氧化物歧化酶、脂氧合酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等氧化還原酶的活性與菇體清除超氧陰離子自由基(O2－·)、羥自由基、過(guò)氧化物的毒害直接有關(guān)[16]；纖維素酶是貯藏后期加速細(xì)胞壁纖維素降解，導(dǎo)致其軟化出水，影響金針菇貯藏保鮮品質(zhì)的重要原因。

3 結(jié) 論

研究不同氧分壓條件下金針菇貯藏過(guò)程中抗氧化相關(guān)酶及其對(duì)保鮮效果的影響。結(jié)果表明：80%氧氣分壓試驗(yàn)組的保鮮效果最好；在貯藏的前2周，SOD、CAT、LOX等酶活性明顯升高，PPO、POD、CMCase等酶活性降低；貯藏2周后SOD、CAT、LOX等酶活性明顯減弱，POD、PPO等酶活力明顯增強(qiáng)，它們對(duì)金針菇的品質(zhì)降低影響較大。SOD、CAT、LOX等酶活性減弱，導(dǎo)致菇體內(nèi)O2·、羥自由基、過(guò)氧化物等逐漸積累，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷加劇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲增多；纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁降解，導(dǎo)致組織軟化出水，以及PPO酶促褐變活力增強(qiáng)，是致使金針菇衰老、加速變質(zhì)、品質(zhì)降低的重要原因。

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Age-related Changes in Antioxidant Enzyme Activities in Golden Needle Mushroom during Modified Atmosphere Storage under Varying Oxygen Content Conditions

WANG Cheng-tao，WANG Chang-tao，ZHAO Lei，LIU Liu，ZHU Xin-na，SUN Bao-guo*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The purpose of this study was to evaluate age-related changes in antioxidant enzyme activities in modified atmosphere packaged (MAP) golden needle mushroom under varying oxygen content conditions during storage at 1－3 ℃. Totally 100 g of golden needle mushroom was placed into polyethylene bags containing 8 g of hygroscopic bentonite and 6 g of activated carbon,in which different modified atmospheres were formed by 0% O2 + 100% N2, 20% O2 + 80% N2, 50% O2 + 50% N2, 70% O2+30% N2, 80% O2 + 20% N2, 90% O2 + 10% N2 and 100% O2 + 0% N2 before storage. Sampling was conducted for determination of antioxidant enzyme activities every 5－7 days. The results showed that modified atmosphere containing 80% O2 had the best fresh-keeping effect on golden needle mushroom. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and lipoxygenase(LOX) were increased obviously, while the activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD) and cellulase (CMCase)displayed an opposite change in the first 2 weeks. With the continuous prolongation of storage, the activities of SOD, CAT and LOX declined remarkably, while POD and PPO showed a significant increase. As a result, superoxide anion and hydroxyl free radicals were accumulated in golden needle mushroom, which leads to the damage of cell membrane structure and the increase in cellular permeability. In conclusion, water seepage and tissue softening resulting from the decomposition of cell-wall by CMCase and the aggravation of enzymatic browning may be the major causes of senescence and quality deterioration in golden needle mushroom.

golden needle mushroom；high oxygen atmospheres packing (HOAP)；antioxidant enzyme system；freshkeeping；senescence

TS201.3

A

1002-6630(2011)08-0300-05

2010-07-21

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADAIB07-11)；國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2007CB707802)；北京市高校人才強(qiáng)教計(jì)劃“中青年骨干”項(xiàng)目(0142131301)

王成濤(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：wct5566@163.com

*通信作者：孫寶國(guó)(1961—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称废懔吓c風(fēng)味化學(xué)。E-mail: sunbg@btbu.edu.cn