奶牛衣原體和布氏桿菌混合感染的診斷

李翠蓉 （西昌學(xué)院 四川 西昌 615013）

牛衣原體病是由鸚鵡熱衣原體引起的呈地方流行性經(jīng)過的人獸共患病，以母牛流產(chǎn)、犢牛肺腸炎、多關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、腦炎和公牛精囊炎等為其主要特征，常使養(yǎng)牛業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對人類健康構(gòu)成威脅。

許多研究者發(fā)現(xiàn)，牛罹患衣原體病時，由于并發(fā)或繼發(fā)感染，常使病情復(fù)雜化，給病的診斷和防治造成很大困難。Mage(1976)在法國檢查1215份流產(chǎn)母牛胎盤時，在244份中發(fā)現(xiàn)了衣原體，在429份中發(fā)現(xiàn)了布氏桿菌。Jahnson(1983)在英國進(jìn)行布氏桿菌病普查時，發(fā)現(xiàn)許多流產(chǎn)母牛血清中合有衣原體抗體。牛衣原體性流產(chǎn)還可能與布氏桿菌病、沙門氏菌病、彎桿菌病、鏈球菌病和毛滴蟲病等混合感染。在對西昌市某奶牛衣原體性流產(chǎn)調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)某些牛群存在著衣原體病與布氏桿菌病的混合感染。

1 材料

1.1 病史

西昌市某規(guī)模化奶牛場有荷斯坦牛78頭、西門塔爾牛125頭(共203頭)，2010年2月起，不同牛舍的4個牛群中，相繼暴發(fā)犢牛肺炎、傳染性結(jié)膜炎、多關(guān)節(jié)炎和妊娠母牛的流產(chǎn)，疫情由點到面，逐漸波及全群，到12月底，共計流產(chǎn)38頭，早產(chǎn)6頭，死產(chǎn)和干尸化胎3頭，發(fā)生病率23.15%。流產(chǎn)多在妊娠7～9月齡，病牛無先兆，流產(chǎn)前后體溫、精神、食欲均正常，有的出現(xiàn)輕度乳房炎癥，60.86%罹病母牛胎衣不下，胎膜出血、水腫，子葉腫大如饅頭，難以剝離，其上有大小不等淡黃色干酪樣壞死灶，受胎率顯著下降。

1.2 病料

采集流產(chǎn)胎犢肝脾1份，羊水和流產(chǎn)母牛陰道分泌物12份，初乳6份，流產(chǎn)10d內(nèi)乳汁6份，母牛血清89份，3～5月齡犢牛血清8份，供病原分離和血清學(xué)檢查用。

2 方法

2.1 血清學(xué)檢查

從不同牛舍的7群牛采集血清97份，60℃30min滅能后作衣原體(CFT)和布氏桿菌(試管凝集反應(yīng))檢查。

2.2 布氏桿菌分離

以無菌技術(shù)將病料接種在血液瓊脂、血清胰蛋胨瓊脂，含1/200000龍膽紫血清胰蛋白瓊脂、馬丁肉湯、厭氣肝湯，置10%CO2環(huán)境培養(yǎng)7～15d，當(dāng)有疑菌落出現(xiàn)時，除進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)和生化特性鑒定外，還將其新鮮培養(yǎng)物以0.5%石炭酸生鹽水制成抗原，與布病診斷液進(jìn)行試管凝集試驗鑒定。同時作其它病原菌常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 衣原體分離

2.3.1 雞胚接種 將病料以含抗生素的pH7.6PBS(鏈霉素2000IU/ml、卡那霉素1000IU/ml∶)制成1∶10懸液，4℃靜置4～6h，2000r/min離心30min，取中層清液5～10ml，以同樣PBS等量混合，再次離心，如此重復(fù)處理3次，用第3次離心的上清液接種6～7日齡雞胚，0.2ml/胚，每份病料接種5枚胚，37℃孵育，收取4～7d死亡雞胚的卵黃囊膜。

2.3.2 染色鏡檢 取死亡雞胚的卵黃囊膜，印痕觸片，以馬契維諾(Macchiavello)法染色鏡檢。步驟為，觸片自然干燥后，以甲醇固定，水洗，滴加堿性復(fù)紅溶液染色5min，水洗，在檸檬酸溶液中脫色3s，至呈粉紅色為宜，水洗，再以美藍(lán)復(fù)染15s，水洗，吸干，鏡檢。

2.3.3 包涵體與碘染試驗 分離菌株的包涵體檢測按《Bergy鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》第8版要求進(jìn)行，病料接種小鼠，取腹水涂片，H·E染色檢查。同時，用在雞胚上繼代4～5次的感染雞胚卵黃囊膜的超薄切片，Lugol碘液染色，鏡檢。

2.3.4 藥敏試驗與動物試驗 分離菌株對磺胺嘧啶鈉敏感性試驗，采用楊宜生等著《衣原體和動物衣原體病》介紹的方法。用感染雞胚卵黃囊膜懸液(滴度為10-7LD50/0.2ml)接種：①妊娠豚鼠4只(腹腔，1.0ml/只)；②幼齡豚鼠4只(皮下，0.5ml/只)；③孕母羊1頭(頸靜脈，10ml)。每種動物均設(shè)有正常雞胚卵黃膜懸液對照。

2.3.5 分離菌株血清學(xué)鑒定 對分離菌株作補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)血清學(xué)鑒定。

3 結(jié)果

3.1 牛群血清

對5群生產(chǎn)母牛77份血清，初產(chǎn)母牛群12份血清和犢牛群8份血清的檢查結(jié)果，衣原體病陽性率為22.68%，布病陽性率為47.43%，兩病均陽性者13.40%(見表1)。

表1 奶牛群血清學(xué)檢查結(jié)果 （Ig）

3.2 布氏桿菌鑒定

從25份病料中分離出5株布氏桿菌(胎犢1株，羊水1株，陰道分泌物2株，初乳1株)，與布病陽性血清進(jìn)行試管凝集反應(yīng)時，除初乳菌株可疑外，其余均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。初代分離時需要10%C02。分離菌株能分解尿素(8～10h)，產(chǎn)生H2S，1/100000堿性復(fù)紅和1/200000龍膽紫不能抑制其生長，可被1/50000硫堇抑制。從而證實分離菌株確系牛布氏桿菌。

部分病料還分離出了葡萄球菌，雙球菌、鏈球菌、大腸桿菌；李氏桿菌、沙門氏菌、彎桿菌和霉形體等分離培養(yǎng)為陰性。

3.3 衣原體鑒定

3.3.1 分離株CY1、CY2、CY3毒力測定與染色鑒定 分別從胎犢、羊水和陰道分泌物中分離出3株衣原體(CY1，CY2，CY3)，在7日齡雞胚上繼代4～5次后，毒價可達(dá)到10-7LD50/0.2ml～10-8LD50/0.2ml。卵黃膜觸片，經(jīng)Macchiavello法染色，15×100倍鏡下觀察，可看到在藍(lán)色背景上有多量的圓形紅色顆粒狀的衣原體。

3.3.2 包涵體與碘染試驗 感染小白鼠腹腔液涂片，染色，鏡檢結(jié)果：（1）在上皮細(xì)胞和白細(xì)胞胞漿中，有零星散在的衣原體，胞漿充滿空泡；（2）衣原體在胞漿中聚積成團(tuán)，但仍較稀疏，大小不一，多少不定，細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度破壞；（3）包涵體致密，位于細(xì)胞核旁，呈現(xiàn)帽狀、饅頭狀、新月狀等形態(tài)，有的細(xì)胞有兩個包涵體；（4）細(xì)胞和包涵體破裂，衣原體散出。感染雞胚卵黃囊膜的超薄切片，碘染包涵體不著色。

3.3.3 動物試驗與藥敏試驗 分離菌株CY1、CY2、CY3可以引起妊娠豚鼠流產(chǎn)、死產(chǎn)，幼齡豚鼠的肺炎，腹膜炎、結(jié)膜炎，孕母羊的高熱綜合征，并從流產(chǎn)豚鼠胎兒、肺炎豚鼠的肺門淋巴結(jié)和胎羔體內(nèi)重分離出衣原體。經(jīng)用7日齡雞胚測定結(jié)果，有磺胺嘧啶鈉組滴度CY1為10-7LD50/0.25ml，CY3為10-7LD50/0.25ml，空白對照(無磺胺嘧啶鈉)為10-7LD50/0.25ml和10-7LD50/0.25ml，結(jié)果一致，說明CY1和CY3對磺胺嘧啶鈉不敏感。

3.3.4 分離菌株血清學(xué)鑒定 CFT表明，分離菌株CY1、CY2、CY3衣原體制備的抗原和抗血清，均能和鸚鵡熱衣原體B11001株(中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供)，發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)，而不與正常雞胚卵黃囊膜制備的抗原和抗皿清發(fā)生反應(yīng)。

4 討論

（1）從西昌市某罹病奶牛群中，同時分離出了鸚鵡熱衣原體和布氏桿菌，這與牛群的發(fā)病情況和血清學(xué)檢查結(jié)果相吻合。由于衣原體和布氏桿菌均可導(dǎo)致母牛繁殖障礙綜合征，在臨床上又一時難以鑒別，更增加了診斷和防治上的困難。（2）衣原體病和布氏桿菌病均為嚴(yán)重威脅人畜健康的人獸共患病，而且，這兩種疫病在奶牛群中同時傳播，又有其不可忽視的流行病學(xué)意義。研究表明，牛衣原體性流產(chǎn)時，能通過初乳和乳汁大量排出衣原體，此研究也證實了這一點。兩種病原的混合感染，在母牛發(fā)病后某一階段能通過乳汁排出大量病原菌，構(gòu)成對犢牛和人群的直接威脅，因此，應(yīng)加強(qiáng)對奶牛衣原體病和布氏桿菌病防治方法研究，并注重在疫場中同時清除這兩種病的綜防措施，已是當(dāng)務(wù)之急。（3）是西昌市首次暴發(fā)奶牛衣原體和布氏桿菌混合感染，并分離出了病原體，同時，對從北方引進(jìn)的一批罹病黃牛群進(jìn)行血清學(xué)檢查時，發(fā)現(xiàn)26.66%(8頭/30頭)的血清中含有診斷意義的衣原體抗體。另一群引進(jìn)的西門塔爾牛的陽性率也達(dá)到10.53%(4頭/38頭)，從而可以初步斷言，我國牛群的衣原體感染可能較為廣泛，應(yīng)引起重視，納入計劃，開展調(diào)查，對我國養(yǎng)牛業(yè)具有重大而深遠(yuǎn)的意義。